Secuenciación de amplicones: lecturas cortas y largas

La secuenciación de amplicón es un tipo de secuenciación dirigida que se puede utilizar para diversos fines. Algunos tipos comunes de secuenciación de amplicón son la secuenciación 16S e ITS, que se utilizan en estudios de filogenia y taxonomía para la identificación de bacterias y hongos, respectivamente. Cuando existe la necesidad de explorar el genoma de manera más general, la secuenciación de amplicón se puede utilizar para descubrir mutaciones somáticas raras, detectar y caracterizar variantes e identificar polimorfismos de nucleótido único (SNP) de la línea germinal, inserciones/deleciones (INDEL) y fusiones conocidas. [1, 2]. Los proyectos de paneles de secuenciación de genes dirigidos son otro ejemplo de secuenciación de amplicones, donde estos paneles incluyen genes que a menudo están asociados con una determinada enfermedad o fenotipo de interés. [3].

En este artículo, repasaremos qué es la secuenciación de amplicones, describiremos las ventajas y desventajas de la secuenciación de lectura corta y larga, y luego explicaremos cómo Genohub puede ayudarlo a respaldar su proyecto.

Secuenciación de amplicones

La secuenciación de amplicón es una secuenciación dirigida que implica el diseño de cebadores específicos para lograr tasas elevadas en el objetivo. Se llama secuenciación de amplicón, porque un paso crucial del proceso es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que es un método que amplifica secuencias de ADN específicas en función de los cebadores utilizados. Los cebadores son pequeños oligos de ADN que están diseñados específicamente para apuntar solo a los genes/regiones de interés. Cuando ocurre la parte de amplificación de la PCR, solo se multiplican estos genes específicos. Los productos finales de la PCR se denominan amplicones, de ahí la secuenciación de amplicones. [1].

Es importante pensar en qué tipo de secuenciación (lectura corta o larga) debe realizarse para su proyecto específico, ya que para secuenciar muestras de amplicón, es necesario agregar los adaptadores apropiados para ayudarlos a adherirse a las celdas de flujo de secuenciación. [2]. Estos adaptadores diferirán según la celda de flujo y, en algunos casos, incluso puede ser más rentable enviar muestras de ADN y hacer que uno de nuestros socios de NGS realice toda la preparación de la biblioteca.

Secuenciación de lectura corta (Illumina)

La secuenciación de amplicones de lectura corta se realiza con plataformas Illumina, a menudo MiSeq, y ha sido el estándar para 16S, ITS y otros proyectos de creación de perfiles microbianos durante muchos años. Ser el estándar durante tanto tiempo tiene ventajas, ya que hay muchos paneles de genes específicos creados y validados para su uso con la secuenciación de Illumina, lo que puede facilitar mucho el flujo de trabajo para los investigadores que son nuevos en la secuenciación específica. También hay una gran cantidad de literatura con la secuenciación de Illumina, por lo que es fácil para los investigadores comparar sus hallazgos con los de otros grupos. La mayor ventaja es que los investigadores pueden secuenciar cientos de genes en una sola ejecución, lo que reduce los costos de secuenciación y el tiempo de respuesta, especialmente si el investigador está interesado en muchos genes diferentes. [1].

Una desventaja de la secuenciación de lectura corta es que la resolución de secuenciación puede no ser tan alta como la secuenciación de lectura larga. Una comparación de la secuenciación de amplicón 16S de lectura corta con la de lectura larga mostró que solo la secuenciación de lectura larga podría proporcionar una resolución de la comunidad a nivel de cepa y una visión de taxones nuevos. Luego, para la parte de metagenómica, se recuperó una mayor cantidad y más completos de genomas ensamblados en metagenoma bacteriano (MAG) a partir de los datos generados a partir de lecturas largas. [4].

Secuenciación de lectura larga (PacBio y Nanopore)

La secuenciación de amplicones de lectura larga se realiza con las plataformas PacBio u Oxford Nanopore. Ambos ofrecen una cobertura completa, contigua, uniforme e imparcial en amplicones largos de hasta 10 kb. Las ventajas de este tipo de secuenciación de amplicón de lectura larga es que es más eficiente, precisa y sensible que la secuenciación de lectura corta.

La secuenciación PacBio puede obtener hasta un 99,999 % de precisión de llamada de bases de una sola molécula y también se ha utilizado para secuenciar secuencias 16S e ITS de longitud completa con una precisión muy alta. [3].

La secuenciación de nanoporos puede proporcionar una llamada de variantes precisa, así como una cobertura sólida de regiones objetivo más grandes, lo que puede ayudar a mejorar el análisis de regiones repetitivas y mejorar la asignación taxonómica. [5]. La secuenciación de nanoporos también tiende a permitir un poco más de flexibilidad que la secuenciación PacBio cuando se trata de escalar proyectos de amplicones a un precio rentable. [6].

Las desventajas de usar la secuenciación de lectura larga para proyectos de amplicones es que tiende a ser mucho más costosa y lenta que la secuenciación de lecturas cortas y, a veces, es posible que ni siquiera se necesiten lecturas largas si los amplicones objetivo en sí ya son muy cortos.

¿Cómo puede ayudarte Genohub?

Los socios de secuenciación de amplicones de Genohub son expertos en cada paso del proceso de secuenciación de amplicones, incluida la extracción, la amplificación por PCR, la ligadura de adaptadores, la preparación de bibliotecas y el análisis de datos. Nuestros socios tienen experiencia en la extracción de muchos tipos diferentes de muestras ambientales y biológicas, pero pueden trabajar igual de bien con su ADN o amplicones si prefiere extraer y/o realizar PCR en su propio laboratorio. Según nuestra experiencia, es más rentable enviar muestras de ADN en lugar de amplicones, a menos que pueda conectar los adaptadores de Illumina usted mismo.

Sabemos que cada proyecto de investigación es único, por lo que tenemos socios que también están abiertos a trabajar con sus cebadores personalizados, paneles de genes personalizados y necesidades bioinformáticas personalizadas. Comience hoy haciéndonos saber acerca de su proyecto de secuenciación de amplicones aquí: https://genohub.com/ngs/ .