La creación de los microscopios significó un avance importante para la ciencia y para los diversos estudios que se realizaron dentro de la rama posteriormente. Desde su surgimiento, han sido los diferentes tipos de aparatos que se han visto, entre ellos el microscopio de fluorescencia. Para conocer más sobre él, continúa leyendo este artículo.
Es una variante del microscopio de luz ultravioleta en donde los objetos que se observan son iluminados con rayos de longitud de onda, muestran una imagen con radiación electromagnética que emiten las propias moléculas que absorbieron esos rayos y los re-emiten con una luz mayor en longitud de onda.
La imagen posteriormente sale visualizada con una emisión secundaria, colocando filtros adecuados debajo del condensador y por encima del objetivo. Estos microscopios se usan para ubicar sustancias que tengan autofluorescencia como es el caso de la vitamina A y de los fluorocromos.
Además la fluorescencia tiene una vida muy corta por las moléculas de los fluorocromos y fluoróforos. Los primeros son moléculas que pueden absorber y emitir los fotones con una mayor longitud de onda, y los segundos son una parte del fluorocromo que puede emitir la fluorescencia.
Este fenómeno físico, se ocasiona cuando existe un electrón de un átomo capaz de absorber la energía de una longitud de onda determinada, llevando la misma a un estado de exaltación, para después pasar nuevamente a su estado orbital.
Un microscopio de Fluorescencia requiere tener una fuente de luz, filtros y objetivos, éstos deben tomar en cuenta qué tipo de óptica necesita, y también qué tipo de diseño óptico necesita para hacer correcciones al infinito, en longitud finita, etc.
Microscopio de epifluorescencia
Este es una variante del microscopio de fluorescencia, en donde a un microscopio tradicional se le acopla o adjunta la fluorescencia, insertándola por encima de su sistema óptico o lentes de aumento y trabaja por la reflexión de la luz.
Un microscopio de tipo óptico debe tener algún elemento esencial para ser usado en trabajos analíticos con fluorescencia, deben poseer objetivos (lentes) que puedan transmitir bien la luz, la mayoría de los lentes se fabrican con fluorita, para algunos casos, estos tienen un costo más elevado que los lentes convencionales.
Pero además, también cuentan con una mejor definición o apertura numérica, aunque este punto no es necesariamente imprescindible para hacer diagnósticos. Es por esto que el accesorio de fluorescencia es complementario en el sistema de iluminación.
Componentes del microscopio de epifluorescencia
Este microscopio debe tener una fuente eléctrica para que funcione, un porta-lámpara que tenga incluida la lámpara de vapor de mercurio, que es mejor que una lámpara halógena o’de tipo led, un sistema que sirva para colectar la luz y los filtros específicos de fluorescencia.
Fuente de alimentación eléctrica: debe tener un transformador de tipo independiente que se pueda alimentar de la lámpara y poseer un contador de hora para verificar el funcionamiento de la misma, debido a que tienen una corta duración, por lo que sus emisiones se van agotando entre 200 a 300 horas de uso.
Portalámparas: es la que debe contener la lámpara de vapor de mercurio, esta se usa en espacios con ventilación porque desprende mucho calor, además, debe tener una protección térmica para evitar quemaduras y un sistema de centrado de lámpara de tres ejes.
Lámpara de Vapor de Mercurio: debe ser de alta presión, esta produce un arco de electricidad incandescente en los polos, positivo y negativo, y allí es donde se van a concentrar las moléculas de gas de mercurio, para que se produzca la luz blanca de mucha intensidad que se va a colocar encima de la muestra en el microscopio.
Esta luz que emite es la que se canaliza a través del sistema colector de la luz y va a seleccionar el haz de la misma para que llegue a los filtros. Estos por lo general se insertan en bloques o soportes planos.
Los filtros que se usan pueden ser de excitación, de división de rayos dicroicos o de emisión. El primero de ellos puede seleccionar longitudes de onda que hacen que un fluoróforo en particular se haga presente en una muestra. Los filtros de emisión, tienen la función de actuar como un control de calidad.
El espejo dicroico tiene por función reflejar la luz en la banda de excitación y que ésta luego se transmita a la banda de emisión lo cual hace que funcione la iluminación clásica de la luz en la forma de la epifluorescencia.
¿Cómo funcionan los microscopios de fluorescencia?
Funcionan a través de la Ley de Stokes y los filtros de fluorescencia. En un microscopio tradicional la iluminación deja ver una muestra a través de la transmisión de la luz que atraviesa la misma, la cual recoge la imagen en el objetivo y esta se puede aumentar a través del ocular para visualizarla.
En un microscopio de fluorescencia se puede ver la muestra por la reflexión de la luz, es decir que la luz se va llevando desde la lámpara de vapor de mercurio hasta el sistema que colecta la luz y de allí al objetivo de aumento o lente ayudando a que la luz se concentre en la muestra.
Una vez allí, hace que ésta se pueda reflejar en una longitud de onda más ancha pero que tenga menor energía. La ley de Stokes, es una ley física que indica que cuando se ilumina un objeto con una luz blanca, el color que tiene el objeto se verá más reflejado.
Si la muestra tiene un color verde, este absorberá las longitudes de onda y la va a reflejar en el mencionado color, si el objeto es negro, absorbe todas las longitudes de onda y si es blanco, éste tiende a reflejar todas las ondas.
Se usan en microscopía biológica y analítica, por su alto grado de sensibilidad y porque son específicos, permitiendo al usuario determinar un solo tipo de molécula, determinar cómo se concentran los iones y también cómo funcionan los procesos intra y extracelulares tales como la endocitosis y la exocitosis.
