Perfilado de ribosomas (Ribo-Seq): una herramienta de alta precisión para cuantificar la traducción de ARNm

RNA-Seq se ha utilizado constantemente durante años como una forma de determinar la expresión génica al correlacionar los niveles de mRNA con los niveles de proteína. Sin embargo, el proceso de traducción real en vivo no puede ser capturado completamente por este método. Esto se debe a que los ribosomas no necesariamente traducen cada molécula de ARNm en proteína. Ribosome Profiling se desarrolló para ayudar a completar esta imagen.

En este blog, repasaremos qué es Ribosome Profiling, algunas aplicaciones del mundo real, un flujo de trabajo típico y cómo Genohub puede ayudarlo con su proyecto Ribo-Seq.

¿Qué es el perfilado de ribosomas?

Para sintetizar proteínas, las células transcriben el ARNm del ADN y luego traducen las proteínas del ARNm. Muchos investigadores que quieren estudiar este proceso de expresión génica han utilizado RNA-Seq, que proporciona datos sobre los niveles relativos de mRNA dentro de una célula. Si bien los niveles de ARNm específico a menudo se correlacionan con los niveles de proteínas particulares, el RNA-Seq estándar no puede proporcionar datos reales sobre la regulación génica a nivel de traducción. Aquí es donde entra en juego el perfilado de ribosomas (Ribo-Seq).

Ribo-Seq es un método de secuenciación que utiliza fragmentos de ARNm protegidos por ribosomas (RPF) específicos para determinar los ARNm que se están traduciendo activamente. en vivo. Esta instantánea luego se puede comparar con el ARN-Seq paralelo realizado para el transcriptoma para revelar las posiciones y cantidades de ribosomas en cualquier ARNm específico.

¿Cuáles son las aplicaciones de Ribo-Seq?

Ribo-Seq puede ayudar a identificar sitios de inicio de traducción de ARNm alternativos, confirmar marcos de lectura abiertos (ORF) anotados y ORF aguas arriba que pueden estar involucrados en la regulación de la traducción, la distribución de ribosomas en un ARNm y la velocidad a la que los ribosomas decodifican los codones. Como Ribo-Seq puede proporcionar datos sobre la expresión génica, la síntesis de proteínas y la abundancia de proteínas, puede ser útil en casi todos los tipos de investigación, incluida la investigación sobre el cáncer, las enfermedades autoinmunes, las enfermedades cardíacas, los trastornos neurológicos y los trastornos psiquiátricos.

Los siguientes son ejemplos en los que se utilizó Ribo-Seq en diferentes tipos de investigación.

• Scheckel et al. usó Ribo-Seq en combinación con otra técnica para descubrir que la traducción aberrante dentro de la glía solo puede ser suficiente para causar síntomas neurológicos graves y puede ser un factor principal de la enfermedad priónica.

• En este papellos autores resumen varios estudios en los que se utilizó Ribo-Seq para identificar nuevos genes dentro de las plantas que podrían ser útiles para aumentar el rendimiento a través de la tolerancia al estrés biótico y abiótico si se manipulan.

• En Este artículo, Ribo-Seq se utilizó para revelar secuencias traducidas dentro de ARN largos no codificantes y para identificar otros micropéptidos dentro de dos herpesvirus, el citomegalovirus humano y el herpesvirus asociado al sarcoma de Kaposi. Comprender la regulación de genes virales y otros aspectos del proteoma es importante para comprender su ciclo de vida e identificar los epítopos que pueden presentar para la vigilancia inmunológica.

¿Cuál es el flujo de trabajo típico de Ribo-Seq?

El flujo de trabajo típico de Ribo-Seq comienza con la recolección y preparación del lisado. En primer lugar, las células o las muestras de tejido se recogen y se congelan instantáneamente para detener la traducción. Luego, las muestras se resuspenden en un tampón de lisis que incluye una sal para estabilizar los ribosomas, un detergente para perforar la membrana celular, una desoxirribonucleasa para degradar el ADN genómico, un fármaco inhibidor de la traducción para detener el ribosoma y un agente reductor para detener la oxidación. compuestos interfieren con el ARN. Después de la lisis, se agregan ribonucleasas para digerir el ARN que no está protegido dentro de los ribosomas. Estos fragmentos se denominan fragmentos protegidos de ARN (RPF). Luego se realiza la selección de tamaño para identificar los RPF de ~28 nucleótidos en un gel y se extrae el ARN. Se elimina cualquier ARNr contaminante, los RPF se transcriben inversamente a ADNc, se amplifican mediante PCR y luego se convierten en bibliotecas que se secuencian.

El análisis de datos realizado dependerá en última instancia del objetivo personal del investigador, pero en general, el mapeo de perfiles de ribosomas incluiría control de calidad de datos, demultiplexación y luego eliminación de secuencias adaptadoras y cualquier contaminante de ARNr restante. Luego, las muestras se alinearían con un genoma/transcriptoma anotado y luego se obtendrían recuentos del número de lecturas alineadas con cada gen. Estos RPF mapeados se pueden visualizar y comparar con lo que han hecho otros investigadores. Un análisis más específico puede incluir detección de uORF, expresión génica diferencial, tasas de traducción global, estancamiento de ribosomas y tasas de decodificación de codones.

¿Dónde puedo obtener ayuda con mi proyecto Ribo-Seq?

A partir de ahora, el kit Illumina para Ribo-Seq, TruSeq Ribo Profile o ART-Seq ha sido descontinuado. Existe un kit de preparación de bibliotecas con todo incluido disponible comercialmente, llamado LACESeq de IMMAGINA Biotechnology. Sin embargo, la preparación de muestras y bibliotecas de Ribo-Seq es tan compleja y específica de muestras que muchos laboratorios tienen sus propios protocolos optimizados para sus muestras específicas y luego usan su kit comercial pequeño de RNA-Seq favorito para la última parte de la preparación de bibliotecas. Para los laboratorios que no se enfocan en este tipo de trabajo, optimizar dicho protocolo puede llevar mucho tiempo y ser costoso.

Los socios de Ribo-Seq de Genohub son expertos en cada paso del proceso de Ribo-Seq, desde la lisis hasta el análisis de datos personalizado, incluida la preparación y ejecución de bibliotecas de RNA-Seq en paralelo, lo que permite medir la eficiencia de la traducción. Nuestros socios dentro de la red también tienen experiencia en el aislamiento de ARNm unido a ribosomas de muchos tipos diferentes de muestras, incluidas bacterias y células eucariotas, y tejido animal y vegetal. Sus protocolos Ribo-Seq optimizados patentados significan que producen bibliotecas de alta calidad de manera rutinaria de manera eficiente y efectiva. Todo lo que tendría que hacer es proporcionar sus muestras de tejido o células congeladas y dejarnos hacer el resto. ¡Estaremos con usted en cada paso del camino, desde la extracción hasta el análisis de datos! Comience hoy haciéndonos saber acerca de su proyecto Ribo-Seq aquí: https://genohub.com/ngs/ .