A Aprobación ética y consentimiento del paciente
El estudio fue aprobado por el Comité de Etica del Instituto del Corazón de la Facultad de Medicina de la Universidad de São Paulo (HCFMUSP) (Cappesq 4435/16/101–15.380) y se condujo siguiendo las directrices de la Declaración de Helsinki. El consentimiento informado se obtuvo de todos los pacientes.
La cirugía de injerto de bypass de arteria coronaria
En la cirugía de injerto de derivación de arteria coronaria, el paciente se somete a anestesia general. La arteria torácica interna izquierda (arteria mamaria interna) y la vena safena se utilizan para realizar un by-pass en las arterias coronarias que se encuentran obstruidas por el proceso de aterosclerosis. Para realizar estos by-pass es necesario desviar la sangre del paciente, que llega por la aurícula derecha, a una máquina de circulación extracorpórea. Esta máquina realiza la función de oxigenar y bombear la sangre de regreso a la aorta del paciente. De esta forma es posible realizar el paro cardíaco del paciente para la confección de las suturas de los vasos, sin detener la circulación sanguínea del paciente.
Criterios de inclusión y exclusión de pacientes, seguimiento y diagnóstico de SV
Este fue un estudio de casos y controles anidado en una cohorte en la que inicialmente se seleccionaron 87 pacientes sometidos consecutivamente a cirugía de injerto de derivación de arteria coronaria con bomba. Los criterios de exclusión fueron cirugía de injerto de bypass de arteria coronaria sin circulación extracorpórea, pacientes que requerían fármacos vasoactivos, necesidad de balón de contrapulsación intraaórtico, presencia de enfermedades del colágeno, neoplasias o infarto agudo de miocardio reciente (< 21 días). De los 76 pacientes que pasaron los criterios de exclusión, 15 desarrollaron SV (19,7%), los mismos que fueron comparados con 15 controles que habían sido sometidos al mismo tipo de cirugía en la misma semana en la institución. Por lo tanto, se utilizó una cohorte de 30 muestras para el perfil de miARN, divididas en pacientes que desarrollaron (grupo VASO, n = 15) y no (grupo NO VASO, n = 15) SV después de cirugía. Los grupos también fueron comparados en cuanto a variables peri, intra y postoperatorias. (Tabla 1).
Se recogieron dos muestras de sangre venosa de 5 ml de todos los pacientes durante la cirugía. El primero, después de la inducción anestésica, durante el paso del catéter venoso central. El segundo, tras abandonar circulación extracorpórea, al menos 15 min tras reversión completa de heparina con protamina. Al final de la cirugía, el paciente fue remitido a la UTI postoperatoria aún con monitor de gasto cardíaco y seguido diariamente por un miembro del grupo de investigación, para conocer los parámetros clínicos y diagnosticar SV en las primeras 48 h posquirúrgicas. Todos los pacientes fueron monitoreados, con un sensor Flo Trac conectado al monitor EV1000, ambos de Edwards Lifescience, para monitorear el índice cardíaco. Los criterios de diagnóstico para VS adoptados en este estudio fueron los descritos previamente en el ensayo VANCS13. Brevemente, el SV se definió como hipotensión (PAM ≤ 65 mmHg) refractaria a al menos 1000 ml de infusión de líquidos cristaloides intravenosos, asociada con un índice cardíaco mayor a 2,2 l/min2/m2, dentro de las primeras 48 h posteriores a la CPB. Era necesario descartar otras causas de shock, como shock cardiogénico, shock hipovolémico o taponamiento cardíaco. Durante el seguimiento, se recopilaron datos clínicos y de laboratorio de los pacientes incluidos para la base de datos Research Electronic Data Capture (REDCAP). Durante el seguimiento, se recopilaron datos clínicos y de laboratorio de los pacientes incluidos para la base de datos Research Electronic Data Capture (REDCAP).
Extracción de ARN de sangre entera y perfilado de miARN
Se recolectó sangre completa para la extracción de ARN de cada paciente en tubos de ARN de sangre Tempus â„¢ y se almacenó a 80℃ y se extrajo el ARN de acuerdo con el protocolo del fabricante, usando el Tempus â„¢ 12-Port RNA Kit de aislamiento (Thermofisher Scientific- USA). Se accedió a la integridad y concentración del ARN total mediante el uso de equipos Nanodrop 2000 (Thermofisher Scientific, EUA) y Bioanalyzer (Agilent, Alemania). El perfil de miARN de los pacientes seleccionados se realizó en el instrumento AB7900 (Applied Biosystems, EE. UU.) usando una tarjeta microfluídica TaqMan™ Array Human MicroRNA A+B Cards- TLDA- v2.0), que permite la evaluación cuantitativa de 754 miRNAs, incluyendo genes endógenos. Brevemente, utilizamos una reacción de RT multiplexada (cebadores de bucle de tallo Megaplex™ RT, kit Human Pool Set v3.0) para producir ADNc a partir de 100 ng de ARN total aislado en un volumen final de 7,5 μL, que contiene 3 μL de ARN total y 4,5 μL de la mezcla RT (0,8 μL Megaplex â„¢ RT Primers (10x), 0,20 μL de dNTP (100 mM), 1,5μL de enzima transcriptasa inversa MultiScribe TM (50U/μL), 0,8 μL de tampón RT (10x), 0,9 μL MgCl2 (25 mM), 0,10 μL de inhibidor de ARNasa (20U/μL) y 0,20 μL de agua libre de nucleasas.La preamplificación se realizó con 2,5 µL del producto de transcripción inversa y 22,5 µL de la mezcla de preamplificación (Thermofisher, EE. UU. ), ambos pasos se realizaron en un equipo Veriti® Thermocycler (Applied Biosystems, EE. UU.), el producto preamplificado obtenido y la mezcla maestra de PCR en tiempo real (TaqMan Universal Master Mix II, no UNG, Thermofisher, EE. UU.) se cargaron en pre Matrices TaqMan de baja densidad impresas.
Análisis no supervisado de perfiles de miARN y análisis estadístico para el potencial de biomarcadores
Para analizar las diferencias en los niveles de miARN entre los dos grupos, cargamos los archivos de datos sin procesar generados en tiempo real (extensión.SDS) en un software Thermofisher Cloud v1.0. Primero, los archivos de datos se preprocesaron utilizando correcciones de línea de base automáticas y se verificaron manualmente para cada ensayo si el valor de Ct correspondía al punto medio de la curva de amplificación logarítmica. El método de ciclo de umbral comparativo se utilizó para calcular los niveles relativos de miARN (∆Ct) después de la normalización media global. Los miARN con un Ct medio > 36 y detectados en <80 % de todas las muestras se consideraron por debajo del nivel de detección y se excluyeron de análisis posteriores. Los miRNAs con valores umbral de PAGSe consideraron ≤0,05 y FC≥1,5 absolutos con niveles desregulados (aumentados o disminuidos). Para los análisis de miRNAs individuales, se utilizó la prueba t pareada para las variables que seguían una distribución normal (prueba de Anderson-Darling), y para las demás, la prueba no paramétrica de Mann-Whitney pareada. Para analizar la asociación entre el resultado y las variables explicativas, se utilizaron modelos de regresión logística simple y múltiple y, para evaluar este modelo, se utilizó C-Statistics (AUC). Las medidas pronósticas del potencial de los biomarcadores se calcularon utilizando el punto de corte por el método de Youden que evalúa la sensibilidad, la especificidad, la precisión, el valor predictivo positivo y negativo. Se consideraron hipótesis de dos colas y se PAG-valor <0,05 se consideró significativo. Se utilizó el software GraphPad Prism versión 8.01 para realizar análisis individuales y curvas ROC.
Predicción de objetivos de miARN y análisis de rutas de enriquecimiento
La predicción de objetivos y la identificación de objetivos putativos de los 7 miARN desregulados en VASO frente a NONVASO se realizaron utilizando el software Ingenuity Pathways Analysis (IPA) (Qiagen, EE. UU.). www.ingenuity.com) que se basa en tres algoritmos de base de datos (TargetScan, TarBase y miRecords). Los análisis de redes y vías canónicas de IPA utilizan una base de datos gráfica de redes de genes que interactúan (Ingenuity Knowledge Base, IKB). Se cargó en IPA una lista que contenía los siete miARN desregulados y se analizó en función del contenido de la fecha 2022-07 utilizando la prueba exacta de Fisher para medir la importancia de la asociación entre cada lista y la vía enriquecida. Las moléculas se representan como nodos y la relación biológica entre dos nodos se representa como un borde (línea). Se crearon diagramas de cuerdas para representar los miARN y sus objetivos putativos relacionados con las vías de señalización de apelina mediante el uso de un software basado en la web (Datasmith.org—Copyright 2021 Ben Peterson).
Evaluación del efecto aguas abajo de los miARN en vías y moléculas
Para predecir el efecto aguas abajo de la activación o inhibición de las moléculas a las que se dirigen los miARN en cada vía canónica, utilizamos una herramienta IPA llamada “Predictor de actividad molecular” (MAP). Primero, encontramos los objetivos de miARN dentro de cada vía y luego, superpusimos los valores de cambio de pliegue de cada miARN desregulado, o especificando interactivamente la activación in silico, asignada manualmente, considerando una relación de expresión inversa entre el miARN y sus objetivos. MAP habilitó el visualización del efecto general en la ruta que produce resultados en los que las moléculas o funciones que se predice que se activarán o inhibirán se colorean en tonos de naranja y azul, respectivamente, en función de una puntuación z calculada. El algoritmo de cálculo de la puntuación z se basa en los datos del IKB a partir de julio de 2022, que divide las moléculas en las vías en dos conjuntos: conjunto 1; las moléculas para las que la actividad está coloreada en rojo y verde cuando se regulan al alza o a la baja, respectivamente, se conocen en función de nuestros datos superpuestos, por ejemplo, miARN desregulados o especificados manualmente, por ejemplo, objetivos de miARN putativos y conjunto 2; moléculas cuya actividad es desconocida. El software calcula el número de moléculas con actividad “desconocida” que está conectada a las moléculas con actividad “conocida” por ciertos tipos de relaciones, y en función de la actividad de la proteína (expresión, transcripción, activación, inhibición, fosforilación) asigna su actividad como aumentado o disminuido.
