Método de detección de patogenicidad de Legionella

La enfermedad del legionario (EL) estalló por primera vez a gran escala en un mitin militar en Filadelfia en 1976, matando a 34 personas. Desde entonces, ha habido brotes o transmisión esporádica de la enfermedad del legionario en la comunidad, en hospitales y en viajes. Legionella es un bacilo gramnegativo intracelular facultativo que existe ampliamente en el agua, el suelo, los sistemas de agua artificial y otros entornos, y se encuentra principalmente en entornos de agua artificial. La bacteria Legionella existe principalmente en agua fría, pero en los últimos años, la bacteria Legionella se ha aislado con frecuencia de los sistemas de agua caliente. Legionella pneumophila (LP) es la principal especie de Legionella que causa la enfermedad del legionario. El monitoreo de Legionella en el medio ambiente y la detección efectiva de su capacidad patógena es de gran importancia para proteger la salud pública y reducir las pérdidas.

Figura 1. Las fuentes de transmisión, el ciclo de vida dentro de los sistemas de agua y los macrófagos humanos, las herramientas de diagnóstico y el tratamiento con antibióticos para la neumonía por Legionella.

Métodos de Biología Molecular

Hay múltiples genes de virulencia en Legionella pneumophila, incluidos mip, ira, lvr, ot, icm, lvh, cpx y rtxA. La proteína codificada por Mip puede resistir la muerte intracelular contra fagocitos de mamíferos y protozoos; cpxRA regula el factor esencial para la secreción de proteínas efectoras por el sistema de secreción tipo IVB; la metiltransferasa codificada por el locus iraA es necesaria para la infección intracelular bacteriana. El hipotético transportador de péptidos de hierro codificado por el locus iraB puede participar en la captación de hierro de alta valencia por medio de péptidos cargados de hierro; el gen lvr es responsable de la regulación de las proteínas secretadas por la familia lvh; rtxA codifica proteínas relacionadas con la adhesión, la citotoxicidad y la formación de poros. Lvh codifica una proteína derivada del sistema de secreción tipo IVA, que ayuda a unir la virulencia; dot/icm codifica una proteína derivada del sistema de secreción tipo IVB, que es responsable de la replicación de Legionella en las células huésped. Los genes de virulencia son regiones distintas de ADN que están presentes en el genoma de bacterias patógenas pero no presentes en las mismas cepas no patógenas o relacionadas. La patogenicidad de Legionella está estrechamente relacionada con su virulencia, y su patogenicidad se determina de acuerdo con los resultados de amplificación de los genes de virulencia patógena. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica de biología molecular utilizada para amplificar la secuencia de nucleótidos diana, y el gen diana que se va a amplificar puede amplificarse varios millones de veces en 2 a 3 horas. Después de la reacción, el producto amplificado se separó por electroforesis en gel de agarosa, y el resultado fue positivo, es decir, se confirmó la existencia del gen. Aunque la calidad de la extracción del ácido nucleico molde no es alta y pueden producirse falsos negativos, este método tiene una fuerte especificidad y una alta sensibilidad, y es la base para otros experimentos de biología molecular.

Además, los métodos de detección de patogenicidad para Legionella basados ​​en PCR incluyen análisis repetidos en tándem de número variable de múltiples locus para detectar el genotipo de virulencia, micromatriz de ADN para detectar genes de virulencia de Legionella y el uso de marcadores genéticos para identificar las condiciones ambientales clínicas y de las cepas de Legionella.

Ensayos basados ​​en inmunología

ELISA

El ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) es una técnica simple y rápida para la detección y cuantificación de anticuerpos o antígenos adheridos a superficies sólidas. El sustrato al que se agrega la enzima produce un cambio de color o una señal luminosa que se correlaciona con la cantidad de antígeno presente en la muestra original. Por lo tanto, la cantidad total de antígeno en la muestra puede calcularse en función de la relación directa entre la intensidad del color o la señal química y la cantidad de antígeno en la cantidad o concentración de la muestra. Este método es simple de operar y tiene alta sensibilidad. Sin embargo, el método tiene altos requisitos para que los técnicos lo operen. Además, se utilizan antígenos recombinantes en el método, y la especificidad no es alta y es probable que se produzcan resultados falsos positivos. Una característica clave de la patogenia de L.pneumophila es la entrada rápida de neutrófilos en el pulmón, y la IL-1α es un iniciador clave del reclutamiento de neutrófilos en los pulmones de ratones infectados con L. pneumophila. Los investigadores utilizaron esta técnica para detectar la cantidad de IL-1α liberada de ratones infectados con Legionella pneumophila y descubrieron que el reclutamiento de neutrófilos era en respuesta a la virulenta Legionella pneumophila, y determinaron la relación entre la cantidad de IL-1α liberada y la cepa.

mancha occidental

El Western Blot es un método basado en la especificidad de las proteínas de unión antígeno-anticuerpo. Las muestras de antígeno mixto se separan mediante electroforesis unidimensional o bidimensional en la placa de gel, y los componentes del antígeno en el gel se transfieren al papel secante bajo la fuerza de adsorción natural del papel secante u otras fuerzas externas, y luego el la membrana de matriz inmovilizada se combina con el papel secante. Y luego, las membranas de matriz inmovilizadas con antígeno se detectaron y analizaron mediante desarrollo de sustrato y autorradiografía. El análisis de transferencia Western es simple, ahorra tiempo y mano de obra, y puede identificar múltiples proteínas al mismo tiempo. Estudios previos han encontrado que los flagelos y sus proteínas secretadas contribuyen al movimiento, la búsqueda de huéspedes, la colonización de biopelículas y la virulencia de L.pneumophila. Por lo tanto, la virulencia bacteriana puede determinarse detectando la L.pneumophila flagelos y sus proteínas secretadas.

Ensayo de citotoxicidad LDH

La lactato deshidrogenasa (LDH) es una proteína estable que existe en el citoplasma de las células normales. Cuando la membrana celular se daña, la LDH se libera fuera de la célula. Existe una buena correlación entre la citotoxicidad de la LDH y la concentración en sangre de la mortalidad animal y humana. El kit de detección de citotoxicidad de LDH se puede utilizar para detectar la actividad de LDH en el sobrenadante celular en un lector de microplacas de 500 nm para determinar el grado de daño celular, detectando así la toxicidad de Legionella. Este ensayo es sensible, simple de operar y preciso; sin embargo, la evaluación de la citotoxicidad se basa en la cuantificación del daño celular, por lo que es necesario determinar la cantidad óptima de células.

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