Los perfiles genómicos y transcriptómicos revelan las características moleculares del carcinoma de paratiroides

Características clínicas y bioquímicas del carcinoma de paratiroides

En total, se recolectaron 50 tejidos tiroideos de tres grupos, 12 carcinomas paratiroideos, 28 adenomas paratiroideos y 10 tejidos paratiroideos normales, para el perfil genómico y transcriptómico (Fig. 1). Los protocolos detallados y los procedimientos de control de calidad se describen en la sección Materiales y métodos. Para el perfil genómico, se realizó WES de tejidos de carcinoma con muestras de sangre coincidentes. Para el perfil transcriptómico, se realizó la secuenciación del ARN para los tres grupos, y los datos resultantes se usaron para análisis de genes y conjuntos de genes.

Primero analizamos las características clínicas y bioquímicas de los tumores de paratiroides (tabla 1). Mientras que los individuos del grupo normal eran los más jóvenes (edad media = 38,4), los individuos del grupo con carcinoma eran más jóvenes (edad media = 42,2, pag= 0,0009, prueba de Mann-Whitney) que los individuos del grupo de adenoma (edad media = 61,3) (Fig. 1 complementaria), lo que representa un factor de riesgo genético prevalente (es decir, pérdida de heterocigosidad en el CDC73 lugar³¹). Encontramos un predominio femenino en los tres grupos (67-89 %), sin diferencias específicas de grupo estadísticamente significativas. Los pacientes con adenoma paratiroideo y carcinoma exhibieron niveles preoperatorios de hormona paratiroidea (PTH) y calcio sérico más altos que los individuos normales, los cuales fueron más altos en pacientes con carcinoma. Asimismo, los niveles de fosfato fueron distintivos entre los tres grupos, mientras que fueron los más bajos en pacientes con carcinoma. Las pruebas genéticas clínicas (secuenciación dirigida de la sangre) identificaron mutaciones de la línea germinal en CDC73 en seis de 12 pacientes con carcinoma, mostrando una frecuencia compatible con las de informes previos (41-61,8%)^10,32. Entre los 12 pacientes con carcinoma de paratiroides, tres tuvieron metástasis a distancia y dos tuvieron recurrencia local durante el seguimiento. Estos hallazgos son consistentes con las características clínicas conocidas y el pronóstico del carcinoma de paratiroides.¹.

Perfiles genómicos del carcinoma de paratiroides

Para investigar el perfil de las variaciones genómicas en el carcinoma de paratiroides, identificamos mutaciones somáticas en 10 muestras de carcinoma (de 12), en las que estaban disponibles muestras de sangre coincidentes (Fig. 2a, ver Métodos). El número de variantes de un solo nucleótido no sinónimas (SNV) y deleciones de inserción (indels) osciló entre 18 y 848, con una mediana de 59, lo que corresponde a 1,18 mutaciones por megabase. Excepto por una muestra con un recuento de mutaciones excepcionalmente alto (P5), todos los carcinomas tenían recuentos de mutaciones relativamente más bajos que otros cánceres.^33,34.

En primer lugar, examinamos los patrones de mutación de CDC73. Se consideraron seis pacientes (P5, P6, P11, P22, P32 y P75) que tenían mutaciones truncantes somáticas o de línea germinal (cuatro SNV sin sentido y siete deleciones de cambio de marco) CDC73-mutante (CDC73^Mut). Encontramos que los loci genómicos de la línea germinal y las mutaciones somáticas estaban claramente separados (Fig. 2b); Las mutaciones de la línea germinal se ubicaron aguas arriba del dominio similar a Ras, que es crucial para la interacción con PAF1 (factor 1 asociado a la polimerasa) y la cromatina.³⁵, mientras que las mutaciones somáticas se agruparon en el exón 1-2, lo que sugiere una pérdida completa de la transcripción. Cuatro de los seis pacientes (P5, P6, P11 y P22) mostraron mutaciones aparentes de dos golpes que causaron la inactivación bialélica de CDC73, conocida como hipótesis de dos aciertos de Knudson (es decir, una predisposición de la línea germinal y una mutación somática adquirida). Un paciente (P32) solo tenía una mutación somática de cambio de marco (CDC73 p.R52Ifs*9), pero estuvo acompañado de una pérdida completa del alelo de tipo salvaje debido a la pérdida de heterocigosidad (LOH), lo que resultó en una inactivación bialélica (Fig. 2c). Un paciente (P75), que solo tenía una mutación truncada en la línea germinal (CDC73 p.E130Gfs*11), mostró una clasificación patológica límite a temprana, lo que indica la posibilidad de una mutación somática subclonal. En general, los patrones de mutación en los seis pacientes mostraron truncamiento CDC73inactivación bialélica consecuente dirigida, oponiéndose a la existencia de hits secundarios en genes distintos de CDC73.

A continuación, evaluamos los perfiles de mutación de cuatro pacientes (P65, P66, P68 y P77) con tipo salvaje CDC73 (CDC73^peso). Encontramos que el número de variantes era menor en CDC73^peso (mediana=29,0) que en CDC73^Mut (mediana=152,5; pag= 0,0095, prueba de Mann-Whitney) pacientes (Fig. 2d), lo que indica una integridad genómica relativamente más alta^36,37. A pesar del número limitado de muestras, observamos algunas mutaciones recurrentes dentro CDC73^peso pacientes Mutaciones somáticas missense en TP53 se observaron en dos CDC73^peso pacientes (TP53 p.C3F en P68 y TP53 p.H61R en P77), los cuales se han informado previamente en otros tipos de cáncer y se espera que sean perjudiciales. Aunque no es estadísticamente significativo (pag= 0,1333, prueba exacta de Fisher), esto puede implicar el confinamiento de TP53 mutaciones en CDC73– Carcinoma de paratiroides independiente. De manera similar, de las tres mutaciones somáticas en CCDC40 (dominio de bobina enrollada que contiene 40), dos mutaciones de cambio de marco de truncamiento (CCDC40 p.K970Nfs*51 y CCDC40 p.G987Rfs*96) fueron encontrados en CDC73^peso pacientes (P65 y P77). El CCDC40 La mutación es mejor conocida como la principal causa de discinesia ciliar primaria, pero aún no se ha informado su asociación con el cáncer. Otras mutaciones en KMT2D, KRAS (eliminación en el marco), y FRAT2 (FRAT regulador de la vía de señalización WNT 2) están potencialmente asociados con la oncogénesis del carcinoma de paratiroides; sin embargo, la evidencia sigue siendo limitada.

El análisis de la firma mutacional reveló dos firmas distintas para cada grupo de carcinoma: SBS13 (firma de sustitución de base única 13) para CDC73^Mut y SBS6 para CDC73^peso (Figura 2ever Métodos). SBS1 también se encontró en el CDC73^Mut grupo, que más tarde se confirmó que era la firma exclusiva de P5 y no presente en todos CDC73^Mut muestra (Fig. 2 complementaria). SBS13, la principal firma encontrada en el CDC73^Mut grupo, es conocido por su asociación con la citidina desaminasa APOBEC activada^38,39 y ha sido propuesto como marcador para inmunoterapia y terapia dirigida^40,41,42. El análisis adicional del enriquecimiento de APOBEC también confirmó una relevancia significativamente alta de APOBEC en el CDC73^Mut (Fig. 2f), lo que podría ser otra pista sobre los diferentes mecanismos de progresión tumoral en CDC73^Mut y CDC73^peso carcinomas.

Análisis transcriptómico del carcinoma de paratiroides

Usando datos de secuenciación de ARN de 49 tejidos (11 carcinomas, 7 CDC73^Mut y 4 CDC73^peso; 28 adenomas; y 10 tejidos paratiroideos normales), se analizaron los DEG (ver Métodos para conocer los criterios) para dos condiciones: carcinoma frente a normal y adenoma frente a normal (Fig. 3a). Encontramos que los perfiles generales de expresión génica estaban altamente conservados en los adenomas, mostrando una fuerte correlación con los de las glándulas paratiroides normales (Pearson’s r = 0.982) (Fig. 4 complementaria). Por el contrario, la expresión génica en carcinomas se desvió sustancialmente (Pearson’s r= 0,943). Por lo tanto, el número de DEG fue mayor en los tejidos de carcinoma (norte = 1,136) que en los tejidos de adenoma (norte = 33), 26 de los cuales se expresaron diferencialmente en ambos. En consecuencia, se identificaron 1110 DEG específicos de carcinoma y siete de adenoma (Fig. 3a, puntos rojos y verdes, respectivamente; consulte la Tabla complementaria 2 para obtener una lista completa de DEG).

El análisis a nivel de vía reveló el enriquecimiento de muchas vías características del cáncer en el carcinoma (Fig. 3b, Tabla 3 complementaria, Fig. 5 complementaria). En particular, las vías involucradas en los objetivos E2F, el punto de control G2M, la glucólisis, los objetivos Myc y la transición epitelial-mesenquimatosa (EMT) se regularon al alza en comparación con las muestras normales (ajustadas). pag-value < 0.01 y FDR < 0.25, ver Métodos). También se observó una leve regulación al alza de las vías diana G2M y Myc en el adenoma, pero KRAS La señalización y la señalización de TNF-alfa estaban reguladas a la baja, en contraste con el carcinoma (pag < 0.003). En los resultados de enriquecimiento de GO de adenoma-DEG, incluidos incluso DEG sutiles de cambio de 1.5 veces a lo normal, se observó una regulación positiva de genes que pertenecen al crecimiento celular o al desarrollo neuronal (Fig. 6 complementaria).

Una evaluación adicional reveló diferencias en la activación de la vía entre CDC73^Mut y CDC73^peso (Tabla complementaria 5, Figura complementaria 5). La regulación positiva de los objetivos E2F se observó de manera más significativa en CDC73^Mutlo que podría sugerir una respuesta de daño de ADN activado contra la mayor carga de mutación⁴³ (Figura 3c). Mientras que la activación de los objetivos E2F y Myc, mTORC1 y la señalización de Hedgehog se observaron comúnmente, CDC73^peso el carcinoma de paratiroides mostró una activación más fuerte de EMT y fosforilación oxidativa (Fig. 3d). Se sabe que la activación de EMT en la progresión tumoral está significativamente involucrada en la tumorigénesis y la angiogénesis. Además, la combinación de fosforilación oxidativa regulada al alza puede ser una fuerte prueba de metástasis.^44,45 y, más concretamente, el fenotipo híbrido E/M^46,47,48. De hecho, uno de los pacientes en el CDC73^peso cohorte mostró múltiples metástasis después de la preparación de la muestra. Aunque no se encontraron signos de metástasis en otros CDC73^peso pacientes, no se puede descartar la posibilidad de metástasis considerando este resultado.

Desequilibrio alélica y expresión alélica específica de CDC73

Como se mostró anteriormente, las mutaciones de dos hits en CDC73 dan como resultado dos alelos separables: un alelo que alberga variantes de la línea germinal (denominado CDC73^Germen) y la otra que adquiere mutaciones somáticas (CDC73^som). El análisis combinado de perfiles genómicos y transcriptómicos permitió la inspección de desequilibrios a nivel de ADN y ARN, incluidas alteraciones del número de copias (CNA) específicas de alelos y sesgos de expresión entre los dos alelos. Detectamos CNA específicos de alelo frecuentes (70%, 7/10) en 1q31.2, que incluían la lesión genética de CDC73 (Fig. 8 complementaria). En particular, las cuatro muestras con CDC73 Las mutaciones de dos hits (P5, P6, P11 y P22) mostraron una frecuencia alélica variante intratumoral elevada (VAF_tumor) de variantes somáticas, mientras que el VAF_tumor de variantes de la línea germinal disminuyó en el ADN tumoral, lo que sugiere ganancias en el número de copias en CDC73^som y/o pérdidas en CDC73^Germen (Fig. 4a, Fig. 9 complementaria, ver Métodos). Asimismo, como se ha descrito previamente (fig. 2c), el paciente con CDC73 LOH (P32) retenido CDC73^som solo. Por lo tanto, los cinco pacientes con CDC73 mutaciones somáticas mostraron una ganancia relativa en CDC73^som.

Un análisis posterior reveló un sesgo adicional a nivel transcripcional. El análisis de RNA-seq específico de alelo (Fig. 4a, Fig. 10 complementaria, ver Métodos) mostró una expresión génica de 2.3 a 7.9 veces mayor en CDC73^som de lo esperado (a partir de la frecuencia alélica a nivel de ADN) en los cuatro pacientes con CDC73 mutaciones de dos golpes. Estos resultados indican que la ganancia alélica en CDC73^som no solo se retiene sino que se intensifica aún más a nivel de transcripción debido a la expresión específica de alelo. Asimismo, encontramos que la expresión génica de CDC73^Germen en P75, que albergaba el CDC73^Germen solo la mutación, fue sustancialmente menor de lo esperado, lo que también respalda la mayor expresión específica de alelo en CDC73^som en los seis CDC73^Mut pacientes

Con base en los resultados, sugerimos un modelo plausible que explica la preferencia dúplex (genómica y transcriptómica) de CDC73^som encima CDC73^Germen (Figura 4b). Nacido con un alelo inactivado (CDC73^Germen), el otro alelo intacto (CDC73^peso) asume únicamente el papel designado del gen, como la homeostasis celular y la supresión de tumores. Esto conduce a un uso más activo de CDC73^peso antes de la tumorigénesis, que puede lograrse ya sea mediante el deterioro CDC73^Germen (p. ej., pérdida de copia o supresión transcripcional) o selección positiva CDC73^peso (p. ej., ganancia de copia o activación transcripcional). En el momento de la tumorigénesis, el segundo golpe (mutaciones de truncamiento somático) convierte CDC73^peso a CDC73^sommanteniendo la preferencia genómica y transcriptómica sobre CDC73^Germen, con ventajas selectivas adicionales adquiridas durante la progresión del tumor. En general, nuestro modelo explica el desequilibrio alélico y la expresión alélica específica en CDC73 basado en la compensación funcional de la haploinsuficiencia de CDC73 causada por mutaciones truncantes de la línea germinal, como se informó varias veces en otros estudios^49,50.

Clasificación molecular del carcinoma y adenoma de paratiroides

Sobre la base de los perfiles de transcripción identificados mediante RNA-seq, construimos un modelo de clasificación molecular para el carcinoma de paratiroides a partir de adenoma y glándulas paratiroides normales. Se seleccionaron un total de 597 genes con una fuerte especificidad de carcinoma de los conjuntos DEG mediante la aplicación del método de filtración más estricto (Fig. 11g complementaria) y se usaron para la agrupación jerárquica de 49 muestras (11 carcinomas, 28 adenomas y 10 tejidos paratiroideos normales) . En el agrupamiento inicial sin ningún entrenamiento ni optimización, encontramos que todas las muestras de carcinoma estaban claramente separadas de las muestras que no eran de carcinoma (Fig. 5), lo que indica diferencias intrínsecas en las características moleculares que están presentes en el conjunto de genes.

La utilidad clínica de la clasificación molecular se demostró en dos pacientes: P27 y P67. A ambos pacientes se les diagnosticó inicialmente una neoplasia paratiroidea atípica con potencial maligno incierto, pero se agruparon por separado; P27 estaba agrupado con carcinoma y P67 estaba agrupado con adenoma (Fig. 5 flechas rojas). El seguimiento prospectivo adicional identificó recurrencia clínica en P27, mientras que no se observaron signos de progresión patológica, incluida la invasión capsular o vascular típica, en P67. Se requieren más estudios a nivel de cohortes para validar la utilidad de la clasificación molecular en casos con potencial maligno incierto, que ocurren en 0.5-5% de los tumores paratiroideos.^1,4.

También encontramos que el grupo sin carcinoma se dividió en dos subgrupos. Por lo tanto, verificamos si son biológicamente distintos entre sí. Sin embargo, los adenomas en el Grupo 1 y el Grupo 2 no mostraron diferencias significativas ni en su transcriptoma ni en su clinicopatología (Figura 13 complementaria, Tabla 6 complementaria).

WT1 como un marcador potencial de CDC73-carcinoma de paratiroides mutante

Utilizando datos de secuenciación del transcriptoma completo, buscamos un posible marcador de un solo gen para el carcinoma de paratiroides. Entre los genes con expresión específica de carcinoma (Fig. 4a puntos rojos), nos enfocamos en el tumor de Wilms 1 (WT1) basado en su relación funcional con CDC73; WT1 se sabe que reprime directamente CDC73 e inducir MI C y BCL-2 para promover la proliferación celular y la tumorigénesis⁵¹. Además, WT1 se ha considerado un biomarcador molecular único para múltiples tipos de cáncer debido a su constante aumento en los tumores^52,53,54.

Probamos la viabilidad de usar WT1 como un biomarcador de un solo gen para CDC73-carcinoma de paratiroides mutante. Encontramos que la sobreexpresión de WT1 en el carcinoma fue específico de CDC73^Mut pacientes pero no presentes en CDC73^peso pacientes (Fig. 6a). Además, la tinción inmunohistoquímica (IHC) de WT1 en 38 tejidos paratiroideos (28 adenomas, 4 CDC73^peso carcinomas y 6 CDC73^Mut carcinomas) confirmaron la presencia de CDC73^Mut–especÃfico WT1 en tejidos de cáncer de paratiroides (Fig. 6b). Es decir, ni adenomas (Fig. 6c) ni CDC73^peso carcinomas (Fig. 6d) se tiñeron con el anticuerpo WT1, pero cinco CDC73^Mut los carcinomas (de 6, Fig. 6e) mostraron tinción positiva (Fig. 14 complementaria para obtener más imágenes de tinción IHC). Dado que las alternativas de empalme específicas de WT1 se sabe que están asociados con ciertas enfermedades, verificamos más a fondo el tipo de transcripción de WT1 con DEXSeq⁵⁵y confirmamos que el sobreexpresado WT1 en el CDC73^Mut El grupo era una transcripción canónica (ESNT00000452863.10, Ensembl 108, Fig. 15 complementaria). Anticipamos que estos resultados proporcionarán una base para el desarrollo futuro de una prueba clínica para un diagnóstico más rápido, económico y preciso del cáncer de paratiroides y su estado de mutación.