Los medios acondicionados y los lisados ​​se recolectaron como se explicó, y la transferencia Western se realizó con el anticuerpo anti-CAR N-terminal 2240 (para medios acondicionados) y el anticuerpo anti-etiqueta V5 (para lisados)

Los medios acondicionados y los lisados ​​se recolectaron como se explicó, y la transferencia de Western se realizó con el anticuerpo anti-CAR N-terminal 2240 (para medios acondicionados) y el anticuerpo anti-etiqueta V5 (para lisados). Niveles de ARNm de ADAM10. Se generaron líneas celulares estables U87 CAR infectadas con lentivirus compuestas de shRNA de control (anti-eGFP) o shRNA anti-ADAM10 (n.º 6675 o n.º 6676). Se aisló ARN de estas células, seguido de transcripción inversa a ADNc y PCR en tiempo real por triplicado para cuantificar los niveles de expresión de ADAM10, ADAM17 y GAPDH. Las dos secuencias de shRNA anti-ADAM10 n.º 6675 y n.º 6676 redujeron con éxito los niveles de mRNA de ADAM10 en comparación con el shRNA de control sin afectar los niveles de expresión del miembro de la familia relacionado ADAM17.(TIF) pone.0073296.s003.tif (39K) GUID:? F2ED8C6D-55B6-4104-9E92-DC38463847CB Physique S4: mapeo de los sitios de escisión de ECD en CAR. Un péptido Icatibant de 20 aminoácidos (VGSDQCMLRLDVVPPSNRAG) que representa la región yuxtamembrana en CAR ECD se digirió con ADAM10 humano recombinante a 37 °C durante 4 o 16 horas, junto con 3 controles (ADAM10 recombinante solo, 16 horas; péptido solo, 16 horas; péptido y ADAM10 recombinante; 0 horas). Las muestras fueron analizadas por MALDI-MS. Se encontraron dos picos únicos (sombreados en gris) a (A) 1008 m/z y (B) 1393 m/z que no estaban presentes en los 3 controles. Se realizó un análisis adicional con MS/MS para deducir las identidades de los aminoácidos en cada fragmento peptídico. Estos resultados representan 2 experimentos imparciales.(TIF) pone.0073296.s004.tif (3.3M) GUID:?20EA966D-BEC5-4AD7-8768-D8F3A4B3E635 Figura S5: Caracterización de mutantes CAR ECD en células U251N de glioma humano. (A) Se generaron líneas celulares U251N estables de simulacro (vector vacante), CAR de tipo salvaje y 3 mutantes (MLAA, RL AA y 221-232). Se ensayó el desprendimiento constitutivo de CAR y de los mutantes. La mutación de pares de aminoácidos a alanina (MLAA y RLAA) condujo a una disminución en la eliminación de CAR ECD. Sin embargo, esta inhibición se invirtió en pases celulares posteriores. La supresión de 12 aminoácidos (221-232) que contenían el área potencial de escisión de ECD dio como resultado un mutante que todavía se desprendía. (B) Se generó un CAR mutante en el que los aminoácidos 224-227 se cambiaron por residuos de alanina (MLRL AAAA) y se expresó de forma estable en células U251N. El desprendimiento de este mutante fue anulado por completo. Los experimentos de biotinilación de la superficie celular (paneles C y D) revelaron que todos los mutantes se expresaron en niveles mucho más bajos en la superficie de las células U251N en comparación con CAR de tipo salvaje.(TIF) pone.0073296.s005.tif (183K) GUID:? BF40FDB9-7D8D-4CC5-AAF4-2E6A0CDE2919 Figura S6: el tratamiento con GM6001 da como resultado una disminución en los niveles de CAR CTF1 y CTF2. Células U87 que expresan CAR de forma estable con un C-terminal Ratón monoclonal a WDR5 La etiqueta V5 (CAR-V5) se trató con 25 M del inhibidor de metaloproteasa GM6001 o su control desfavorable durante 4 horas. Los medios acondicionados y los lisados ​​se recolectaron como se explicó, y se realizó transferencia Western con el anticuerpo 2240 anti-CAR N-terminal (para medios acondicionados) y anticuerpo anti-etiqueta V5 (para lisados). El tratamiento con GM6001 anuló la eliminación de ECD de CAR Icatibant como se esperaba. Hubo una pequeña disminución en los niveles de CAR CTF1 y CTF2 con el tratamiento GM6001.(TIF) pone.0073296.s006.tif (280K) GUID:?17CEB546-BCE5-48DE-A36D-BCD537E9A8DB Physique S7: imágenes de pila Z de un Célula U87 que expresa transitoriamente CAR ICD. Se adquirieron imágenes de pila Z de microscopía confocal de una célula U87 que expresa transitoriamente CAR ICD marcado con V5 (rojizo = anti-V5). Se muestran 20 cortes que representan un espesor total de 6,59 m. Barra de nivel: 5 m.(TIF) pone.0073296.s007.tif (1.1M) GUID:?30355A48-7FEB-435D-9DFB-26E715F68EEC Físico S8: CAR ICD suele estar sujeto a degradación proteasómica. (A) Las células U87 CAR-V5 se trataron durante 16 horas con el inhibidor del proteasoma epoxomicina (1 M o 5 M) frente al vehículo DMSO. Por lo general, se muestra un Western blot representativo realizado con un anticuerpo generado contra la etiqueta V5. (B) Las intensidades de las bandas de CTF1 y CTF2 se cuantificaron a partir de transferencias Western y se calcularon las proporciones de CTF2/CTF1. El gráfico representa las proporciones medias de CTF2/CTF1 obtenidas de 3 experimentos imparciales (n=3 por grupo). ANOVA unidireccional con postest de Bonferroni, * = p 0,05. (C) Las células U87 que expresan transitoriamente CAR ICD marcado con V5 se trataron durante la noche con el inhibidor de proteasoma MG132 (25 M) o el control del vehículo DMSO. Las muestras se analizaron mediante transferencia Western para GAPDH y la etiqueta V5. El tratamiento con MG132 condujo a una acumulación de niveles de CAR ICD.(TIF) pone.0073296.s008.tif (821K) GUID:?BEDCD1F9-11EB-4BAE-86FA-6E910345FAA1 Resumen El Coxsackievirus and Adenovirus Receptor (CAR) es un receptor de adhesión celular molécula caracterizada originalmente como un receptor de virus informáticos, pero posteriormente se demostró que icatibant participar en procesos fisiológicos como el desarrollo neuronal y cardíaco, la integridad de las uniones estrechas epiteliales y la supresión de tumores. La proteólisis de las moléculas de adhesión celular y el icatibant, una amplia variedad de otras proteínas de la superficie celular, sirven como mecanismo para el recambio de proteínas y, en algunos casos, para la señalización celular. Las metaloproteasas como los miembros de la familia A Desintegrina y Metaloproteasa (ADAM) se escinden.