Eliminación selectiva eficiente del precursor de la toxina urémica mediante estructuras orgánicas covalentes unidas a olefinas para el tratamiento de la nefropatía

Diseño y síntesis de COF ligados a olefina

Los COF unidos a olefina tienen un alto grado de estabilidad estructural para garantizar que no se degraden en el tracto gastrointestinal después de la administración oral, lo que también es su principal ventaja para las aplicaciones in vivo.²⁷. Además, la estructura porosa regular y sintonizable de los COF facilita la elucidación del mecanismo de adsorción. Por lo tanto, se eligió racionalmente un COF ultramicroporoso unido a olefina (NKCOF-12) para la eliminación de indol y se preparó a partir de 2,4,6-trimetil-1,3,5-triazina (TMT) y 1,3,5-triformilbenceno. (TFB) seguido de polimerización en estado fundido²⁶. Para evaluar exhaustivamente el efecto de confinamiento, sintetizamos además dos COF isoestructurales (TMTTPT-COF y TMTTPA-COF) con diferentes tamaños de poro para comparar (Fig. 1 complementaria)²⁶. Las estructuras químicas y cristalinas de los COF unidos a olefinas (Fig. 2a) se caracterizaron sin ambigüedades mediante varios métodos analíticos. Como se muestra en la Fig. 2b y la Fig. 2 complementaria, la existencia de nuevas bandas de absorbancia características a 1630 cm^−1 en el espectro infrarrojo de transformada de Fourier (FT-IR) reveló la formación de enlaces C‰=‰C en los esqueletos COF unidos a olefina. Los datos en el espectro de difracción de rayos X en polvo (PXRD) confirmaron la formación exitosa de los COF específicos con un alto grado de cristalinidad. El pico de difracción característico a 9,3° (Fig. 2c) correspondía a los reflejos planos (100) de las celdas hexagonales, lo que indica que NKCOF-12 formó la estructura ultramicroporosa deseada. De manera similar, los patrones de PXRD experimentales de los materiales de control (TMTTPT-COF y TMTTPA-COF) también fueron consistentes con los patrones de PXRD simulados (Fig. 3 complementaria). norte₂ Se realizó un experimento de adsorción-desorción para evaluar la porosidad y la distribución del tamaño de los poros de COF y AST-120 (Fig. 2d y Fig. 4 complementaria). Como se muestra en la Fig. 2d, NKCOF-12 exhibió una isoterma reversible tipo I típica a 77 K, lo que indica su estructura ultramicroporosa con un área de superficie Brunauer-Emmett-Teller (BET) de 559 m²/gramo. La distribución del tamaño de poro calculada por la teoría funcional de la densidad no lineal mostró que NKCOF-12 tenía un tamaño de poro estrecho de 0,6 nm (recuadro de la Fig. 2d). TMTTPT-COF y TMTTPA-COF poseían superficies BET de 1015 y 1436 m²/g y tamaños de poro de 1,5 nm y 1,8 nm, respectivamente, que son consistentes con los resultados reportados en la literatura²⁶. Por el contrario, AST-120 poseía una superficie BET de 1469 m²/g y una amplia distribución de tamaño de poro de 0,6 a 1,8 nm. Se realizó microscopía electrónica de barrido (SEM) para investigar las microestructuras de COF con diferentes tamaños de poro. Los resultados mostraron que NKCOF-12 y los COF contrastivos poseían una morfología similar (Fig. 2e y Fig. 5 complementaria). La distribución del tamaño de partícula de NKCOF-12 se estimó a través de una imagen SEM, que estaba entre 8 y 16 m (Fig. 2f). Los COF contrastivos tenían amplias distribuciones de tamaño de partícula (Fig. 6 complementaria). NKCOF-12 y los COF contrastivos retuvieron una cristalinidad superior después del tratamiento con fluidos gástricos e intestinales que contenían enzimas y soluciones acuosas a diferentes valores de pH (Fig. 2g y Figs. Complementarias 7, 8), mostrando la excelente estabilidad requerida para eliminar el indol de el tracto gastrointestinal.

Rendimiento de captura de COF ligados a olefina y AST-120 para indol en el entorno intestinal simulado

El indol se absorbe en la sangre a través de las células epiteliales intestinales y luego se sintetiza en IS por oxidación y sulfatación en el hígado. Por lo tanto, es extremadamente necesario realizar experimentos de adsorción de indol en fluido intestinal simulado para simular el proceso de aplicación in vivo de COF. Como resultado, AST-120 tuvo la capacidad de adsorción de equilibrio más alta de 16.51 μg mg^−1seguido de NKCOF-12 (13,31 μg mg^−1), TMTTPT-COF (10.84 μg mg^−1), y TMTTPA-COF (3.200 μg mg^−1) (Fig. 3a). Sin embargo, en comparación con AST-120, el equilibrio de adsorción de los COF se alcanzó rápidamente en 15 min. La cinética de adsorción superior de los COF contribuyó a adsorber el indol y reducir la ingesta intestinal de indol, lo que disminuyó el nivel sérico de IS. Se utilizaron dos modelos cinéticos comunes, es decir, modelos cinéticos de cuasi primer orden y cuasi segundo orden para investigar la tasa de adsorción de los COF hacia el indol y el mecanismo del proceso de adsorción (las ecuaciones detalladas del modelo se pueden ver en la Información complementaria) . La Fig. 9a y la Fig. 3b complementarias presentan los diagramas de ajuste de los modelos cinéticos de cuasi-primer y cuasi-segundo orden para la adsorción de indol en COF a diferentes concentraciones iniciales (10, 50, 100, 200 y 300 μg mL^−1). Los parámetros cinéticos de adsorción de NKCOF-12 hacia el indol se enumeran en la Tabla complementaria 1. Se puede ver que el modelo de casi segundo orden proporcionó un valor mayor del coeficiente de correlación R² (R²â€‰> 0.99). Los datos demostraron que la cinética de adsorción de NKCOF-12 exhibió un mejor cumplimiento con el modelo cinético de casi segundo orden, lo que indica que el paso limitante de la velocidad del proceso de captura de NKCOF-12 hacia el indol fue la adsorción química. Además, también se realizó el ajuste cinético de otros COF vinculados a olefinas (Tabla complementaria 1).

Se exploraron las isotermas de adsorción para evaluar la capacidad de adsorción de los COF unidos a olefinas hacia el indol, en el que las concentraciones iniciales oscilaron entre 10 μ g ø ml^−1 a 300 μg mL^−1. Los modelos de isotermas de Langmuir y Freundlich fueron aplicables a la adsorción en monocapa con un número limitado de sitios homogéneos y la adsorción en multicapa de adsorbato sobre la superficie heterogénea de los adsorbentes, respectivamente.²⁸. En el presente estudio, los datos de adsorción obtenidos se modelaron con modelos de isoterma de Langmuir y Freundlich. Los resultados de ajuste se muestran en la figura complementaria 9b y en la figura 3c. Los parámetros de isoterma de adsorción detallados de los COF unidos a olefina hacia el indol se enumeran en la Tabla complementaria 2. En términos de R más alto² valores, se encontró que el modelo de Freundlich era más adecuado para describir el proceso de adsorción de indol en COF, mientras que el modelo de Langmuir se ajustaba principalmente a los datos de adsorción de AST-120. Los resultados indicaron que la adsorción de indol ocurrió por un mecanismo heterogéneo y multicapa. “n†es el factor de heterogeneidad energética del modelo de Freundlich, que está relacionado con la propiedad de adsorción²⁹. El factor “1/n” indica la favorabilidad de la adsorción³⁰. Cuando 1/n está por encima de 1, la adsorción es pobre; de lo contrario, la reacción de adsorción es fácil³¹. En nuestro estudio, el valor 1/n de NKCOF-12 fue de 0,6 (Tabla complementaria 2), lo que indica que el proceso de adsorción de indol fue fácil de realizar.

A aclarar qué tan fuertemente fue adsorbido el indol por los adsorbentes en el ambiente intestinal, se realizaron experimentos de liberación en materiales precargados con indol utilizando fluido intestinal libre de enzimas como eluyente. Los resultados demostraron que NKCOF-12 poseía la tasa de liberación acumulada más baja en comparación con los COF con tamaños de poro más grandes (es decir, TMTTPT-COF y TMTTPA-COF), lo que implica que el tamaño de poro apropiado proporcionó una adsorción más estrecha hacia el indol (Fig. 3d). Además, los datos de PXRD demostraron que la adsorción de indol no afectó el grado de cristalinidad de los adsorbentes (Fig. 10 complementaria).

Afinidad y selectividad de los COF hacia el indol

Para evitar la pérdida de nutrientes y fármacos en el intestino, el proceso de captación de adsorbentes hacia el indol debe ser selectivo. En el presente estudio, el ácido indol-3-acético, el ácido quinurénico y el triptófano, que coexisten con el indol en el intestino y tienen estructuras similares al indol, se seleccionaron como sustratos de comparación para explorar la adsorción selectiva de los COF hacia el indol. Los resultados experimentales revelaron que NKCOF-12 poseía una mayor afinidad y capacidad de absorción (13.31 μg mg^−1) hacia el indol que los otros adsorbentes (Fig. 4a y Fig. 11 complementaria). Además, se investigó la selectividad de adsorción de NKCOF-12 hacia el indol mediante la detección de la tasa de eliminación de indol de un sistema de mezcla multicomponente compuesto por cuatro compuestos (indol, triptófano, ácido quinurénico y ácido indol-3-acético). Como se muestra en la Fig. 4b y la Fig. 4c, NKCOF-12 mostró una propiedad de adsorción selectiva excelente para el indol, y la capacidad de adsorción de NKCOF-12 para el indol en 15 min fue equivalente a la de AST-120, que fue propicio para prevenir la captación intestinal de indol en poco tiempo.

Según la literatura³², la fuerza electrostática y el enlace de hidrógeno son los principales factores utilizados para estudiar las interacciones huésped-huésped, lo que proporciona una nueva visión del mecanismo de adsorción selectiva de NKCOF-12 para el indol. Se determinaron los potenciales zeta de NKCOF-12, indol y otras sustancias (ácido indol-3-acético, ácido quinurénico y triptófano). La Figura 4d ilustró que el indol poseía un potencial zeta (+), que se puede combinar con la carga negativa (−) de NKCOF-12 a través de la interacción electrostática. Presumimos que el anillo de triazina rico en nitrógeno podría unirse al enlace NH del indol para formar enlaces de hidrógeno. Como se muestra en la Fig. 4e, la banda de absorción de vibraciones de estiramiento NH a 3400 cm^−1 de indol se debilitó, el γ_{NUEVA HAMPSHIRE} vibración a 720 cm^−1 mostró un desplazamiento hacia el rojo y una nueva banda de absorción a aproximadamente 740 cm^−1 para NKCOF-12 apareció. Todos estos cambios en el espectro de absorción infrarrojo probaron la hipótesis de la formación de puentes de hidrógeno. Los resultados de la medición del ángulo de contacto con el agua mostraron que NKCOF-12 se consideraba un material más hidrofílico con un ángulo de contacto con el agua de aproximadamente 39° en comparación con TMTTPT-COF y TMTTPA-COF (Fig. 4f y Fig. 12 complementaria). ), y la hidrofilia más fuerte de NKCOF-12 contribuyó a la absorción de indol del líquido intestinal. Además, se ha informado que la selectividad de tamaño de los COF es la base de la interacción selectiva entre los COF y los compuestos objetivo.³³. El tamaño molecular (0,5 nm × 0,6 nm) del indol coincidía perfectamente con el tamaño de poro (0,6 nm) de NKCOF-12 (Fig. 5), lo que indica interacciones huésped-huésped más fuertes. Dado todo eso, la alta selectividad de NKCOF-12 hacia el indol resultó de múltiples efectos, como la selectividad de tamaño, la fuerza electrostática y la fuerza de enlace de hidrógeno.

Además, también se realizó el estudio de adsorción competitiva de los COF hacia el indol usando otros nutrientes (es decir, glucosa, L-fenilalanina y vitamina B1) contenidos en el fluido intestinal como competidores. Los resultados experimentales mostraron que NKCOF-12 poseía una mayor capacidad de absorción hacia el indol que los otros adsorbentes en un sistema de solución única (Figuras complementarias 13a-d). Además, se investigó la adsorción competitiva de NKCOF-12 hacia el indol mediante la detección de la tasa de eliminación de indol de un sistema de mezcla compuesto por tres nutrientes (glucosa, L-fenilalanina y vitamina B1) e indol. Se descubrió que NKCOF-12 también exhibió una excelente propiedad de adsorción selectiva para el indol (Fig. 13e, f complementaria). Los resultados anteriores confirmaron además que NKCOF-12 poseía una mayor selectividad por el indol y puede evitar la pérdida de nutrientes intestinales.

Experimento de citocompatibilidad y captación celular de COF

La citocompatibilidad in vitro de los COF se evaluó utilizando células Caco-2 por el 3-[4,5-dimethylthial-zol-2-yl]-Método del bromuro de 2,5-difeniltetrazolio (MTT). Como se muestra en la Fig. 6a, el ensayo MTT reveló que la viabilidad celular superaba el 80 % después de 24 h de incubación con NKCOF-12 cuando las concentraciones oscilaban entre 0,05 y 0,8 mg ml.^−1. Se puede considerar que NKCOF-12 no tiene una citotoxicidad obvia y posee una buena biocompatibilidad. Los datos de viabilidad celular de los otros adsorbentes se muestran en la Fig. 14 complementaria. La absorción celular se evaluó cualitativamente utilizando un microscopio de barrido láser confocal (CLSM), y no se observó señal fluorescente de NKCOF-12 en las células (Fig. 6b ), lo que sugiere además que las células no pueden absorber NKCOF-12. La pobre internalización celular de NKCOF-12, TMTTPT-COF y TMTTPA-COF (Fig. 15 complementaria) podría atribuirse principalmente a las interacciones electrostáticas repulsivas entre los COF cargados negativamente y las membranas celulares cargadas negativamente.³⁴, así como la repulsión entre las membranas celulares hidrofílicas NKCOF-12 y lipofílicas. Todos los resultados anteriores confirmaron completamente que los COF eran seguros, no tóxicos y que las células no podían absorberlos, lo que indica una gran perspectiva de aplicación en el campo biomédico. Además, es necesario realizar pruebas de biocompatibilidad y eficacia in vivo cuando se utilizan COF para eliminar el indol del intestino. Teniendo en cuenta la excelente estabilidad, la eficiencia de adsorción más alta y la tasa de liberación de indol más baja de NKCOF-12, se aplicó a experimentos con animales posteriores para explorar más a fondo la biocompatibilidad in vivo y el efecto sobre el nivel de IS en suero.

Experimentos con animales y detección del nivel de IS en suero

Para lograr la aplicación de NKCOF-12 en la eliminación de indol in vivo y evaluar la eficacia de eliminación de indol de NKCOF-12, es importante analizar la toxicidad y eficacia in vivo de NKCOF-12 y detectar el contenido de suero IS. En el presente estudio, la toxicidad in vivo de NKCOF-12 se evaluó por primera vez en ratones C57BL/6 J. Los ratones se dividieron aleatoriamente en un grupo normal y un grupo NKCOF-12. Evaluamos el efecto de NKCOF-12 sobre el peso corporal y el índice de peso de órganos de ratones normales. Los resultados (Fig. 16 complementaria) indicaron que el peso corporal y el índice de peso de los órganos de los ratones en el grupo NKCOF-12 no fueron significativamente anormales en comparación con el grupo normal. Además, el efecto de NKCOF-12 en los órganos principales (corazón, hígado, bazo, pulmón, riñón, estómago e intestino) se evaluó más mediante tinción con hematoxilina y eosina (H&E). Los resultados de la tinción con H&E (Fig. 17 complementaria) no mostraron daño tisular significativo ni cambios patológicos en ninguno de los órganos principales después de la administración oral de NKCOF-12 durante 8 semanas. Por último, suero Se realizó la bioquímica y los resultados no mostraron cambios evidentes en la función hepática (alanina aminotransferasa (ALT) y aspartato aminotransferasa (AST)) o renal (nitrógeno ureico en sangre (BUN) y creatinina (Cr)) después de 8 semanas (Fig. 18). Todos los ensayos de toxicidad anteriores confirmaron la alta bioseguridad de NKCOF-12, lo que indica que los COF tienen un gran potencial para la aplicación in vivo. Inspirándonos en la alta bioseguridad de NKCOF-12 in vivo, investigamos más a fondo la eficacia de NKCOF-12 en ratones con ERC y exploramos su efecto sobre la toxina urémica IS in vivo. Treinta y dos ratones se dividieron aleatoriamente en 4 grupos que contenían los grupos normal, modelo, NKCOF-12 y AST-120. Los síntomas de la lesión renal crónica inducida por adenina en ratones son básicamente los mismos que las características clínicas de la ERC en humanos. De acuerdo con los métodos reportados en la literatura³⁵, el modelo de ERC del ratón se estableció mediante la inducción de la dieta con adenina, excepto para el grupo normal (Fig. 19 complementaria). Cr y BUN son los índices de prueba más importantes que reflejan la función renal. Para investigar si el modelo se estableció con éxito, se llevó a cabo la tinción con H&E de tejido renal de ratones en los grupos normal y modelo, y se detectaron los niveles séricos de Cr y BUN en los dos grupos. Los niveles elevados de Cr y BUN en suero (Fig. 20 complementaria) y la patología anormal de la tinción de H&E del riñón (Fig. 21 complementaria) indicaron que el modelo de ERC se estableció con éxito.

Después de modelar con éxito, los ratones con ERC en los grupos NKCOF-12 y AST-120 recibieron sondas orales de NKCOF-12 y AST-120, respectivamente. Se evaluó el efecto de la intervención farmacológica sobre la patología renal, así como el nivel de IS en suero en ratones con ERC. El peso corporal y el índice de peso renal en el grupo modelo se redujeron significativamente en comparación con los del grupo normal (PAG < 0.001) (Suplementario Fig. 22 y Fig. 7a). El índice de peso renal en los grupos NKCOF-12 y AST-120 fue más alto que en el grupo modelo (PAG < 0.05), mientras que no hubo diferencia significativa entre los grupos NKCOF-12 y AST-120 (PAG > 0.05). Estos resultados demostraron que tanto NKCOF-12 como AST-120 podrían retrasar hasta cierto punto el daño renal. Mientras tanto, los niveles séricos de Cr y BUN de los grupos NKCOF-12 y AST-120 no fueron significativamente diferentes de los del grupo modelo (Fig. 7b, c, P‰>‰0.05), lo que sugiere que NKCOF- 12 y AST-120 no tuvieron un efecto evidente sobre los índices de función renal de los ratones con ERC. Además, los niveles séricos de IS en diferentes grupos después de la administración oral de NKCOF-12 y AST-120 durante 8 semanas se cuantificaron directamente mediante un kit de inmunoensayo ligado a enzimas. La Figura 7d muestra claramente que NKCOF-12 y AST-120 redujeron significativamente el nivel de IS en suero en comparación con el grupo modelo (PAG < 0.001). Los resultados demostraron plenamente que NKCOF-12 podía eliminar eficazmente el indol, reduciendo así el nivel sérico de IS. Además, NKCOF-12 tuvo la misma eficacia que AST-120. Por lo tanto, es factible utilizar NKCOF-12 como alternativa a AST-120 para reducir el nivel de IS en suero de ratones con ERC.

Además, las micrografías de la tinción con H&E del tejido renal mostraron que había necrosis evidente, infiltración de células inflamatorias y fibrosis en los túbulos renales del grupo modelo, mientras que el tratamiento con NKCOF-12 y AST-120 no revirtió el daño tisular (Fig. 8a). La tinción de Masson, en la que las fibras de colágeno se tiñen de azul y el citoplasma de las miofibrillas se tiñe de rojo, se ha convertido en un medio para detectar la fibrosis tisular.³⁶. Como se muestra en la Fig. 8d, se produjo más depósito de fibras de colágeno en el riñón del grupo modelo en comparación con el grupo normal, y el área de fibrosis disminuyó después de la intervención de NKCOF-12 y AST-120, pero no hubo una diferencia significativa (PAG > 0.05) (Fig. 7e). Los datos experimentales confirmaron además que NKCOF-12 puede retardar la progresión de manera efectiva, aunque no puede revertir la lesión renal. A partir de las micrografías de tinción H&E de tejidos hepáticos e intestinales, podemos ver que no hubo daño hepático e intestinal evidente en el grupo NKCOF-12 (Fig. 8b, c). Y encontramos que no hubo diferencias significativas en el índice de peso del hígado y los índices de función hepática entre los dos grupos (Figuras complementarias 23, 24). Estos resultados confirmaron además que NKCOF-12 no tuvo efectos secundarios en los ratones y ejerció una excelente biocompatibilidad in vivo, lo que podría atribuirse al hecho de que NKCOF-12 no puede ser absorbido por el tracto intestinal y no producirá hepatotoxicidad a través de la circulación sanguínea.

Para evaluar la selectividad de NKCOF-12 de una manera más integral, se analizó el contenido intestinal de ratones con o sin tratamiento con NKCOF-12/AST-120 en base a experimentos con animales. Triptófano y sus metabolitos (es decir, indol, ácido indol-3-acético, ácido quinurénico, triptamina, indol-3-carboxaldehído y ácido indol-3-propiónico), así como varios nutrientes (es decir, L-fenilalanina y vitamina B1) en el cecal de ratones de diferentes grupos se cuantificó mediante cromatografía líquida de rendimiento ultraalto junto con espectrometría de masas en tándem con trampa de iones lineal de triple cuadrupolo (UHPLC-QTRAP-MS/MS). De acuerdo con la literatura, la concentración de indol en el contenido intestinal se ve afectada por la dieta y el entorno de vida de los ratones, que van desde 4,76 µg^−1 a 9.39 µg g^{−1 37}. En nuestro estudio, la concentración de indol en ratones normales fue de 5,12 ± 1,13 µg^−1, lo cual fue consistente con los resultados reportados en la literatura. Sin embargo, la concentración de indol en el grupo modelo fue de 7,19 ± 1,75 µg.^−1ligeramente superior a la del grupo normal, lo que puede contribuir a la disbiosis del microbioma intestinal en la enfermedad de ERC, lo que provoca la formación de metabolitos potencialmente tóxicos, como el indol⁷. Después del tratamiento con NKCOF-12 y AST-120, la concentración de indol en el contenido intestinal fue de 3,62 ± 0,36 µg.^−1 y 3,92±0,74µg^−1respectivamente, significativamente más bajo que el del grupo modelo (PAG < 0.01) (Fig. Complementaria 25). Los resultados demostraron plenamente que NKCOF-12 podía eliminar eficazmente el indol, reduciendo así el nivel sérico de IS. Además, NKCOF-12 podría eliminar eficazmente el indol del intestino sin provocar la pérdida de otras sustancias en comparación con AST-120, evitando así la pérdida de nutrientes y fármacos intestinales. En combinación con los resultados previos de adsorción selectiva y competitiva de COF y AST-120, se confirmó además que NKCOF-12 poseía una mayor selectividad hacia el indol que AST-120.

En conclusión, se preparó con éxito un COF ligado a olefina ultramicroporoso (NKCOF-12) con buena biocompatibilidad y excelente selectividad de adsorción para el indol mediante el método de síntesis de polimerización en estado fundido. Varios resultados y análisis experimentales demuestran que NKCOF-12 ejerce las siguientes ventajas: (1) el método de síntesis sin consumo de solvente se ajusta al concepto de síntesis verde; (2) exhibe buena estabilidad bajo las condiciones de pH gastrointestinal simulado; (3) posee un tamaño de poro ajustable y presenta una propiedad de adsorción selectiva excelente para el indol; (4) tiene una buena citocompatibilidad, lo que reduce el riesgo de toxicidad; (5) NKCOF-12 no tiene efectos secundarios debido a su buena biocompatibilidad in vivo, lo que redujo efectivamente el nivel sérico de IS. Además, NKCOF-12 exhibe una propiedad de adsorción de mayor selectividad hacia el indol en comparación con el adsorbente comercial AST-120 que se ha utilizado clínicamente, lo que lo hace muy atractivo y prometedor para la eliminación de toxinas urémicas. Por lo tanto, el presente estudio abre nuevas ideas para la eliminación de IS mediante una estrategia sin diálisis basada en COF y amplía las aplicaciones in vivo de los COF. Mientras tanto, este estudio proporciona nuevas ideas de investigación para retrasar la progresión de la lesión renal inducida por ácido aristolóquico, la estrategia sin diálisis desarrollada tendrá una gran perspectiva de aplicación en el tratamiento de la nefropatía inducida por medicamentos a base de hierbas.