CoreGenomics: 10X actualizaciones de genómica

Hoy tuvimos un seminario de 10X Genomics para presentar algunas de las actualizaciones más recientes sobre sus sistemas y química. La nueva química para la expresión génica unicelular y el lanzamiento de un controlador unicelular específico muestran cuánto esfuerzo ha puesto 10X en el análisis unicelular como motor de la empresa. La fase se parece mucho al primo pobre en este momento, pero aún representa un método importante para comprender la organización, la regulación y la epigenética del genoma.

3’mRNA-seq V2 de una sola célula: la actualización más importante desde mi perspectiva fue que las bibliotecas 10X ahora se pueden ejecutar en HiSeq 4000, en lugar de solo 2500 y NextSeq. Esto significa que podemos ejecutarlos junto con nuestra secuenciación estándar (aunque con un tipo de ejecución un poco extraño).

La nueva química me ofrecesensibilidad mejorada para detectar más genes por célula, iSensibilidad mejorada para detectar más transcripciones por célula, una actualización Canalización de análisis de Cell Ranger 1.2, y ccompatibilidad con todos los secuenciadores Illumina – sla secuenciación todavía está emparejada, pero se lee 1 = 26 pb para código de barras 10X y UMI, el índice 1 es el código de barras de muestra, se lee 2 = la lectura de ADNc hacia la cola poliA.

Es realmente importante en todos los sistemas unicelulares preparar y contar cuidadosamente las células antes de comenzar. DEBE tener una suspensión unicelular y load 100-2000 células por microlitro en un volumen de 33,8ul. esto significa cEl recuento de células va a ser muy importante ya que la concentración cargada afecta el número de células finalmente secuenciadas y también la tasa de dobletes. El recuento de células puede ser muy variable; 10X recomienda usar un hemocitómetro o a Condesa de tecnología de la vida. Las células adherentes deben ser tratadas con tripsina y filtradas usando un Filtro de células Flowmi o similar. Las células muertas y/o las células lisadas pueden confundir el análisis al filtrar el ARN en la suspensión celular; esto puede detectarse monitoreando el nivel de transcripción de fondo en los códigos de barras de las células. el yoEs probable que la interpretación de los gráficos de control de calidad proporcionados por 10X sea muy importante, pero todavía no existen muchos ejemplos de estos gráficos, por lo que los usuarios deben comunicarse entre sí.

Hay una tasa de doblete reportada por 1000 células de 0,8%, que mantiene 10X en el extremo inferior de las tasas de doblete en sistemas de una sola celda. Sin embargo, todavía no está claro exactamente cuál es el impacto de esto en los diferentes tipos de experimentos con los que se nos pide ayuda. Sospecho que veremos más publicaciones sobre el impacto de la tasa de doblete y herramientas de análisis para detectar y solucionar estos problemas.

La secuenciación por celda depende en gran medida de cuál sea su pregunta. 10X recomendado 50 000 lecturas por celda, lo que debería detectar 1200 transcripciones en BMC o 6000 en celdas HEK293. No está del todo claro cuánta profundidad adicional aumentarán los genes detectados antes de llegar a la saturación, pero no vale la pena pasar de las 150 000 lecturas por celda.

1 millón de células individuales: 10X también presentó un gráfico tSNE en 3D del recientemente lanzado Experimento de 1 millón de células. Este fue un análisis de la corteza, el hipocampo y la zona ventricular del ratón E18. El millón de celdas individuales se procesaron como 136 bibliotecas en 17 chips Chromium y 4 celdas de flujo HiSeq 4000. Este trabajo fue completado por una persona en una semana. Es sorprendente pensar cuán rápido los experimentos de una sola célula han crecido de 100 a 1000 de células y se han vuelto tan simples de hacer.

Secuenciación adicional en curso para alcanzar ~20 000 lecturas por celda. Todos los datos sin procesar y procesados ​​se publicarán sin restricciones.

La cantidad de celdas requeridas para detectar una población todavía es algo en lo que la gente está trabajando. El conjunto de datos de 1 millón de celdas probablemente ayudará a la comunidad al brindar un conjunto de datos enriquecido que los usuarios pueden analizar y probar nuevos métodos computacionales.

Lo que sigue de 10X: Un nuevo ensayo que se lanzará en la primavera de 2017 es para la secuenciación V(D)J de células únicas, lo que permite la creación de perfiles de células inmunitarias de alta definición.

El seminario contó con una gran asistencia, lo que demuestra cuánto interés hay en los métodos unicelulares. Las preguntas durante y después del seminario incluyeron los costos de realizar experimentos de una sola célula, el uso de complementos (por ejemplo, ERCC, SIRV, Sequins), trabajar con núcleos, etc.

Al responder a la pregunta sobre el trabajo con núcleos 10X dijo «lo intentamos y es bastante dificil»…la principal dificultad fue la lisis de un solo núcleo en las gotas de gel. Si bien es posible que no podamos obtenerlo con una resolución de una sola célula, esta dificultad para lisar el núcleo en lugar de la célula podría ser una forma de medir y comparar las transcripciones nucleares con las citoplasmáticas.

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