Actividad antipalúdica in vitro e in vivo y perfil químico de hojas de caña de azúcar

Materiales vegetales

Se recolectaron hojas frescas de caña de azúcar de la granja de plantas medicinales de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Uyo, estado de Akwa Ibom en junio de 2020 después de obtener el permiso y la aprobación de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Uyo. Las hojas fueron posteriormente identificadas y autenticadas como Saccharum officinarum Linn. por la Prof. Margaret Bassey en el Departamento de Botánica y Estudios Ecológicos de la Universidad de Uyo, Uyo, Nigeria y se depositó un espécimen de prueba (UUPH 215b) en el herbario del Departamento de Farmacognosia y Medicina Natural de la Universidad. Todos los procedimientos y la recolección de material vegetal se realizaron de acuerdo con los lineamientos y regulaciones locales y nacionales.

Extracción y fraccionamiento de los materiales vegetales.

hojas frescas de S. officinarum se lavaron, se cortaron en trozos más pequeños y se secaron a temperatura ambiente durante dos semanas. Las hojas se redujeron aún más a polvo utilizando un molinillo eléctrico. El polvo de hoja (2 kg) se empapó en etanol al 50 % (7,5 l) a temperatura ambiente durante 3 días. Posteriormente se filtró y el filtrado líquido se concentró a sequedad en vacío por debajo de 40 °C utilizando un evaporador rotatorio (BuchiLab, Suiza). El extracto crudo (50,0 g) se disolvió en agua (200 ml) y se repartió usando norte-hexano, diclorometano (DCM), acetato de etilo y norte-butanol (4 × 500 mL cada uno) para obtener las fracciones solvente y acuosa. Los rendimientos calculados del extracto y las fracciones fueron extracto crudo-3,52%, norte-hexano-0,12%, DCM-0,16%, acetato de etilo-0,14% y norte-butanol-0,84%. El extracto y las fracciones se almacenaron a 4 °C en un refrigerador.

Ensayos de inhibición del crecimiento in vitro

La cepa del parásito utilizada para las pruebas in vitro fue la Dd2lucia cepa resistente a la cloroquina de P falciparum (obtenido de la Escuela de Medicina Tropical e Higiene de Liverpool, Liverpool, Reino Unido)21. Los parásitos se mantuvieron como un cultivo continuo a 2% de hematocrito (HCT), 1 a 5% de parasitemia e incubados a 37 °C.22. El medio RPMI-1640 suplementado se cambió diariamente21. Se agregaron extractos o fracciones a microplacas de 96 pocillos, con una concentración inicial de 700 µg/mL, y se llevó a cabo una dilución en serie doble a lo largo de la placa. P falciparum Se añadió cultivo a todos los pocillos, con una parasitemia final de trofozoítos del 1 al 2 % (18 a 28 h después de la infección) con un HCT al 2 %. Se usó un control positivo de glóbulos rojos infectados sin tratar para representar el 100% de crecimiento de parásitos. Un control negativo de glóbulos rojos infectados tratados con una dosis supraletal de cloroquina (10 µM) representó un crecimiento del 0 %. Las placas se incubaron a 37 ° C durante 48 h en una incubadora suministrada con 1% de oxígeno, 3% de dióxido de carbono y 96% de nitrógeno.

Ensayos de fluorescencia (MSF) SYBR Green I de malaria23 de crecimiento del parásito se llevaron a cabo para la pantalla preliminar de cuatro puntos. El colorante SYBR Green I (Thermo Scientific, Reino Unido) se diluyó en tampón de lisis 1 × MSF (Tris HCl 20 mM, pH 7,5, EDTA 5 mM, saponina al 0,08 % p/v y Triton X-100 al 0,08 % p/v) a una relación 1:5000. A una placa negra de 96 pocillos, se transfirieron 100 μl de cultivo de la placa incubada, seguidos de 100 μl de tampón de lisis 1 × MSF y colorante. Esta placa se dejó incubar durante una hora en la oscuridad. A continuación, se leyó la señal de fluorescencia con el sistema de detección múltiple Glomax (Promega, Reino Unido) con el módulo de fluorescencia azul (excitación 490 nm: emisión 510-570 nm). Crecimiento del parásito en las curvas de inhibición del crecimiento de nueve puntos, utilizadas para estimar la CE50, se midieron usando un ensayo de bioluminiscencia de luciferasa21. A una placa blanca de 96 pocillos, se añadieron 40 μl de cultivo de la placa de prueba, 10 μl de tampón de lisis pasiva 5 × (Promega, Reino Unido) y 50 μl de sustrato de luciferasa (Promega, Reino Unido). La señal bioluminiscente se registró utilizando Glomax Multi Detection. CE50 los valores se estimaron a partir de las curvas trazadas del crecimiento normalizado del parásito frente a la concentración transformada log10 de extracto/fracciones (GraphPad v5.0, Prism).

animales de experimentación

Los ratones albinos suizos (18-25 g), machos y hembras, utilizados en el estudio se obtuvieron de las instalaciones para animales de la Universidad de Uyo. Se alojaron en jaulas de plástico estándar en una habitación bien ventilada (28,0 ± 2 °C; 12 h día/ciclo de luz). Los ratones recibieron una dieta granulado estándar y agua ad libitum. Los protocolos de los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio del Instituto Nacional de Salud.24. El estudio fue aprobado por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Uyo (UU/CHS/AE/21/068).

Administración de Drogas

Todos los tratamientos: extracto, fracciones, cloroquina y pirimetamina, en este estudio se administraron por vía oral utilizando una cánula de alimentación metálica inoxidable.

Pruebas de toxicidad aguda

Las pruebas de toxicidad aguda se llevaron a cabo determinando la dosis letal mediana (LD50) del extracto por vía intraperitoneal utilizando un método modificado de Lorke25. A diferentes grupos de ratones (n = 3) se les administró dosis variables del extracto (100-5000 mg/kg). Los signos físicos de toxicidad y la mortalidad se registraron en cada grupo dentro de las 24 h. el dl50 El valor se calculó como la media geométrica de la dosis mínima que produce el 100 % de mortalidad y la dosis máxima que produce el 0 % de mortalidad según el método de Lorke.25.

Plasmodium berghei inoculación

La cepa ANKA de P. berghei fue proporcionado por el Instituto Nacional de Investigación Médica (NIMER), Yaba Lagos, Nigeria. Cada ratón utilizado en el experimento se inoculó por vía intraperitoneal con 0,2 ml de sangre infectada que contenía aproximadamente 1‰Ã—‰107 P. berghei eritrocitos parasitados recogidos de un ratón infectado con 20-30% de parasitemia. El inóculo consistió en 5 × 107 P. berghei eritrocitos infectados por mililitro preparado determinando tanto el porcentaje de parasitemia como el recuento de eritrocitos del ratón donante y diluyendo la sangre con solución salina isotónica en las proporciones indicadas por ambas determinaciones8,26,27. La parasitemia se controló mediante métodos estándar; Se hicieron frotis de sangre delgados en portaobjetos de vidrio, se fijaron con metanol y se tiñeron con tinción de Giemsa al 10%. La parasitemia se contó utilizando un microscopio óptico (lente de inmersión en aceite de ×100) y se determinó como la proporción de glóbulos rojos infectados observados en relación con el número total de células en varios campos microscópicos.28.

Evaluación in vivo de las actividades supresoras del S. officinarum extracto de hoja y fracciones

Las actividades supresoras del extracto de hoja, fracciones y cloroquina contra P. berghei infección en ratones se probaron usando métodos descritos previamente26,27,29. El estudio involucró a cincuenta y cuatro ratones que fueron inoculados con el parásito el primer día (D0) y luego se dividieron en nueve grupos, cada uno de los cuales constaba de seis ratones. Los ratones fueron tratados como sigue; a los grupos 1-3 se les administró por vía oral 170, 340 y 510 mg/kg de extracto crudo respectivamente, a los grupos 4-7 se les administró de manera similar 340 mg/kg cada uno de norte-hexano, DCM, acetato de etilo y norte-fracciones de butanol respectivamente, los ratones infectados en el grupo 8 recibieron 5 mg/kg de cloroquina por vía oral (control positivo) y el grupo 9, que era el grupo de control negativo, recibió 10 ml/kg de agua destilada diariamente durante cuatro días (D0–D3) entre las 8 y las 9 de la mañana El quinto día (D4), se prepararon películas delgadas a partir de sangre recolectada de la cola de cada ratón, que posteriormente se tiñó con Giemsa al 10 % para revelar el recuento de eritrocitos parasitados. La supresión promedio de parasitemia y el porcentaje de quimiosupresión se calcularon de la siguiente manera8,28.

$$frac} times 100$$

El tiempo medio de supervivencia (MST) de los ratones en cada grupo de tratamiento se midió como se informó anteriormente26,27.

Determinación de in vivo actividades profilácticas del extracto de hoja y fracciones de S. officinarum

Se evaluaron las actividades profilácticas del extracto y las fracciones utilizando el método descrito anteriormente.30. Los ratones fueron tratados como sigue; a los grupos 1-3 se les administró por vía oral 170, 340 y 510 mg/kg de extracto crudo respectivamente, a los grupos 4-7 se les administró de manera similar 340 mg/kg por vía oral cada uno de norte-hexano, DCM, acetato de etilo y nortefracciones de -butanol respectivamente. El grupo 8, que era el grupo de control positivo, recibió 1,2 mg/kg de pirimetamina y el control negativo, el grupo 9, recibió 10 ml/kg de agua destilada. Los ratones fueron tratados con el extracto y las fracciones durante tres días consecutivos (D0–D2), mientras que se prepararon películas delgadas a partir de sangre recolectada de la cola de cada ratón en el cuarto día (D3) del estudio para evaluar el nivel de parasitemia de los ratones en cada grupo. Los animales fueron observados durante un período de 29 días y la mortalidad en cada grupo se registró con la fecha que se utilizó para calcular el MST del animal.26.

Efecto del extracto de hoja y fracciones de S. officinarum en establecido P. berghei infección en ratones

Los efectos curativos de los extractos, fracciones y cloroquina en P. berghei ratones infectados fueron investigados usando el modelo curativo modificado descrito27,31. Los 54 ratones utilizados en este estudio fueron infectados intraperitonealmente con P. berghei en el día inicial (D0) de El estudio. Tres días después de la infección (D3), los ratones se distribuyeron en 9 grupos de 6 ratones cada uno. El extracto de hoja (170, 340 y 510 mg/kg) se administró respectivamente a los grupos 1 a 3 por vía oral, 340 mg/kg a cada uno de ellos. norte-hexano, acetato de etilo, DCM y norte-Las fracciones de butanol se administraron por vía oral respectivamente a los grupos 4-7. Al grupo 8 como grupo de control positivo se le administró por vía oral 5 mg/kg de cloroquina y al grupo 9, al grupo de control negativo se le administró por vía oral 10 ml/kg de agua destilada. Todos los tratamientos, extracto crudo, fracciones y cloroquina, se administraron por vía oral una vez al día durante 5 días. Se utilizó sangre de la cola de cada ratón para preparar frotis finos teñidos con Giemsa. Se recogió sangre de la cola todos los días de tratamiento para controlar la parasitemia. La temperatura rectal de cada ratón individual se controló y registró diariamente durante todo el período de tratamiento.32. Los animales fueron observados durante un período de 29 días (D0–D28) y la mortalidad en cada grupo se registró con la fecha que se utilizó para calcular el tiempo medio de supervivencia del animal8,26,27.

Análisis de cromatografía de gases-espectrometría de masas

Los datos de cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS) de las fracciones se registraron en un cromatógrafo de gases Agilent 7890A conectado con un detector Agilent MS modelo 5975C MSD (Agilent Technologies, EE. UU.). Se utilizó una columna HP5-MS de fenilmetilpolisiloxano al 5 %, 30 m × 0,25 mm × 0,25 µm con un flujo de gas helio a una presión de 10 psi. La temperatura del inyector se fijó en 280 °C. La temperatura del horno comenzó desde 150 °C durante 3 min y aumentó a 300 °C a 10 °C/min, y se mantuvo durante 5 min a 300 °C. El espectrómetro de masas se hizo funcionar utilizando el modo de ionización de electrones a 70 eV. El extracto total o las fracciones se inyectaron directamente en norte-hexano o después de derivatizar para formar derivados de TMSi con norte,O-Bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida (BSTFA) como se describió anteriormente7,33,34. Los fitoquímicos se identificaron mediante la comparación de espectros en la base de datos NIST 2011.

Cromatografía líquida de alta resolución con análisis de detección de espectrofotometría ultravioleta-visible (HPLC-UV/vis)

Para el análisis HPLC-UV/vis de la fracción de DCM no polar, se prepararon 4 mg/mL de fracción de DCM de caña de azúcar en metanol y se inyectaron 20 µL en el HPLC con una columna HPLC analítica acoplada con un detector UV-Vis (Phenomenex, Reino Unido; tamaño de partícula de 5 µm, 4,6 × 250 mm). La fase móvil utilizó dos sistemas de disolventes. El disolvente A consistía en agua con TFA al 0,1 % y el disolvente B era metanol al 100 %. La calibración de la fase móvil comenzó con 50 % B y aumentó a 100 % B durante 25 min y se mantuvo al 100 % B durante 6 min a un caudal de 1 ml/min a 215 nm y 254 nm de absorbancia. Para el análisis por HPLC de la fracción de butanol más polar, se prepararon 4 mg/mL de la fracción de butanol de caña de azúcar en metanol. Se inyectaron 20 µL del extracto en HPLC para su análisis. La fase móvil utilizó dos sistemas de disolventes. El disolvente A consistía en agua con TFA al 0,1 % y el disolvente B era metanol al 100 %. La calibración de la fase móvil se mantuvo al 100 % A durante 10 min y el disolvente B aumentó al 60 % durante 30 min. Además, B aumentó al 100 % en 10 s y se mantuvo al 100 % durante 10 min a un caudal de 1 ml/min a 254 nm y 350 nm de absorbancia.

Análisis de cromatografía líquida de espectrometría de masas de tiempo de vuelo (LC-TOF-MS)

Para el análisis de Fracción de DCM y butanol de la caña de azúcar como se describió anteriormente7,35. Se realizó una LC-Q-ToF-MS/MS adicional con una fuente de iones de ionización por electropulverización (ESI) utilizando la función automática MS/MS en el software MassHunter (Agilent Technologies).

Los parámetros de detección de MS se establecieron de la siguiente manera: temperatura del gas de secado, 300 °C; caudal de gas de secado (N2), 11,0 L/min; voltaje del fragmentador, 125 V; nebulizador, 50 psig y capilar, 4000 V; skimmer, 65 V; Oct RF Vpp, 750 V. La energía de colisión de la muestra se fijó en 15 y 40 V. Toda la adquisición y el análisis de datos fueron controlados por el software MassHunter (Agilent Technologies). Los espectros de masas se registraron en el rango de m/z 100-1000 en MS y 100-800 para MS/MS con medición de masa precisa de todos los picos de masa. Cada muestra se analizó tanto en modo positivo como negativo para brindar abundante información para la identificación estructural.

Se pulverizó continuamente una solución de calibración externa (solución de calibración Agilent) en la fuente ESI del sistema Q-TOF, empleando los iones con m/z 112.9855 (anión TFA) y 1033.9881 [HP-0921 (TFA adduct)] en modo negativo y m/z 121.0509 (purina) y m/z 922.0098 (HP921) en modo positivo para recalibrar el eje de masa, lo que garantiza la precisión y la reproducibilidad de la masa a lo largo de la ejecución cromatográfica.

Se inyectaron de 1 a 2 µL de fracciones de DCM y butanol disueltas en ácido fórmico al 0,1 % en metanol en una columna de LC de calibre estrecho (Infinity Lab Poroshell 120 EC-C18, 2,1‰ × 100 mm, tamaño de partícula, 2,7 µm, Thermo Fisher Scientific, Reino Unido) junto con un detector A con un rango de masas de 100–1000 m/z. Para el análisis de la fracción de DCM, se fijó un caudal de disolvente de 0,3 ml/min aumentando del 50 al 100 % de B durante 25 min y luego manteniéndolo al 100 % de B durante 6 min. Los disolventes A y B son ácido fórmico al 0,1 % en agua y metanol, respectivamente. Para el análisis de la fracción de butanol, se fijó un caudal de disolvente de 0,3 ml/min manteniendo el 0 % de B durante 10 min y aumentando al 60 % (de 10 a 50 min) y manteniendo el 100 % de B durante 10 min. Para la anotación de compuestos, los archivos de datos .d sin procesar se convirtieron en archivos .abf utilizando Reifycs Analysis Base File Converter (https://www.reifycs.com/AbfConverter/), que luego se llevaron a cabo utilizando MS-DIAL ver.4.80 (Riken, Universidad de Osaka, Japón)36 con bases de datos espectrales MS-Dial metabolomics MPS (disponibles en:http://prime.psc.riken.jp/compms/msdial/main.html; última actualización el 19 de abril de 2022).

Análisis de espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN)

1Análisis de espectroscopía de RMN H (400 MHz) y espectroscopía de coherencia cuántica única heteronuclear (HSQC) de la fracción DCM (CDCl3) y fracción de butanol (DMSO-d6) se registraron utilizando un instrumento de RMN Brucker de 400 MHz.

análisis estadístico

Los valores se representan como media ± desviación estándar (SD) o error estándar de la media (SEM) y la significación relativa al control se consideró en p Ë‚Â 0,05. Los datos recopilados en este estudio se analizaron mediante ANOVA unidireccional seguido de una prueba de comparación múltiple post-hoc de Tukey Kramer utilizando el software GraphPad Prism. Inc. (5.0, La Jolla, CA, EE. UU.).

Declaración

El estudio con animales se informa de acuerdo con las pautas de ARRIVE (https://arriveguidelines.org).

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