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97.330.67%; ns; higo. así como anticuerpos disponibles comercialmente, respectivamente. Además, medimos los efectos de los agonistas y antagonistas selectivos para 5-HT2AR y 5-HT2BR administrados por vía intraarterial sobre las descargas del nervio frénico en ratas jóvenes que utilizan la preparación perfundida del tronco encefálico. Las drogas causaron cambios significativos en la actividad de descarga. La coadministración de ambos agonistas reveló una dominancia del 5-HT2BR. Dada la naturaleza de las vías de señalización, investigamos si el calcio intracelular puede explicar los efectos observados en la red respiratoria de Rolapitant. En conjunto, los resultados de este estudio sugieren un papel importante de ambos receptores en la modulación de la red respiratoria. Introducción Los estudios inmunohistoquímicos y electrofisiológicos llevados a cabo durante los últimos veinte años han proporcionado evidencia considerable de que la serotonina (5-HT) liberada desde los núcleos del raf medular caudal modula las descargas de la red respiratoria en las regiones bulbar y espinal. [1]C[8]. La investigación posterior se propuso determinar qué subtipos de receptores 5-HT (5-HTR) son operativos como objetivos farmacológicos para una terapia potencial para tratar los trastornos respiratorios de origen central. [9]C[17]. Esos estudios revelaron que los receptores 5-HT1A, 5-HT2A/C y 5-HT4(a) modulan las propiedades de descarga de la red respiratoria. Estos receptores representan solo una fracción de los subtipos de 5-HTR que modulan la excitabilidad de las neuronas del SNC a través de diversas vías de señalización. Entre la familia 5-HTR, los 5-HT2R incluyen las isoformas 5-HT2A, 5-HT2B y 5-HT2CR que se acoplan preferentemente a las proteínas Gq/11. La activación resultante de Rolapitant de la fosfolipasa C (PLC) aumenta la hidrólisis de los fosfatos de inositol y eleva el Ca2+ citosólico. [18], [19]. Los 5-HT2R se encuentran postsinápticamente [20]C[22]y hay evidencia de que modulan la neurotransmisión en varios sitios sinápticos centrales y periféricos [23], [24]. Los 5-HT2AR estimulan PLC, lo que conduce a la activación de la proteína quinasa C (PKC) y aumenta la excitabilidad en las neuronas respiratorias bulbares [25]C[27]. Estudios anteriores demostraron la modulación del patrón respiratorio mediada por la vía PKC [26] y excitación de las vías respiratorias Efnb2 neuronas por activación de 5-HT2ARs [25], [27]. Además de la modulación directa del patrón motor respiratorio, los 5-HT2AR pueden tener un papel clave en la inducción de la facilitación a largo plazo de la actividad del nervio frénico en respuesta a la hipoxia intermitente. [28]C[31]. Los 5-HT2BR se han relacionado con la ansiedad, la esquizofrenia, el autismo, la migraña y la propagación de la depresión. [32]. Además, la captación de serotonina dependiente de 5-HT2BR influye en el nivel plasmático de serotonina. [33]. Los 5-HT2BR también son importantes reguladores del desarrollo embrionario; la inactivación del gen 5-HT2BR conduce a la muerte embrionaria parcial y neonatal temprana en ratones [34]. En la red respiratoria, se ha demostrado que los 5-HT2BR mejoran la actividad de descarga motora rítmica registrada en ratones recién nacidos es idéntica, las 3 secuencias difieren. Por lo tanto, para la RT-PCR se utilizó el cebador directo de rata, mientras que el cebador inverso para el ratón estaba a 94 °C, 4 min/38[94C, 1 min/55C, 1 min/72C, 2 min]/72C, 10 min/4C en espera. Se usó (-actina) como estándar interno para todas las reacciones de PCR. (e) RT-PCR en tiempo real La cuantificación relativa y la expresión génica en tejidos específicos de rata se realizó mediante análisis de RT-PCR en tiempo real. La médula espinal, la oliva inferior, el complejo pre-Bötzinger y el complejo parabraquial se diseccionaron de las correspondientes secciones de criostato de 300 m de espesor (P32; n=∼3 animales) bajo control visual. El ácido ribonucleico (ARN) total del tejido cerebral homogeneizado se aisló usando el Trizol? método de acuerdo con las instrucciones del fabricante (GibcoBRL) y su concentración se determinó usando el espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 seguido de su calidad e integridad medida por electroforesis en RNA 6000 LabChip? kit (bioanalizador Agilent 2100). El ARN se transcribió en el ácido desoxirribonucleico (ADNc) correspondiente utilizando el kit de síntesis de ADNc iScript (BioRad). Los siguientes pares de cebadores se diseñaron utilizando el programa Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/): (“tipo”:”entrez-nucleótido”,”attrs”:”texto”:”NM_017254. 1″,”term_id”:”8393582″,”term_text”:”NM_017254.1″NM_017254.1): F ((“tipo”:”entrez-nucleótido”,”attrs”:”texto”:”NM_017250.1 ″,”term_id”:”8393585″,”term_text”:”NM_017250.1″NM_017250.1): F ((“tipo”:”entrez-nucleótido”,”attrs”:”texto”:”NM_012583.2″ ,”term_id”:”70778838″,”term_text”:”NM_012583.2″NM_012583.2): F (a 95C durante 60 s, 42 ciclos de (95C/10 s y 60C/30 s), y una última aumento gradual de 0,5 C en la temperatura de 60 C a 90 C. Todas las cuantificaciones en tiempo real se realizaron utilizando el sistema iCycler iQ (BioRad) y se ajustaron utilizando el método de acuerdo con rolapitant Pfaffl [41]. Imágenes de calcio de células que expresan recombinantemente 5-HT2AR o 5-HT2BR La preparación perfundida del tronco encefálico, debido a su grosor y necesidad de perfusión constante, no es adecuada para el análisis microscópico. Por lo tanto, optamos por obtener imágenes de calcio en células de neuroblastoma murino N1E-115, donde la expresión endógena de 5-HT2R es insignificante, pero se sabe que emiten señales a través de la vía PLC-DAG. [42], [43]. Otra ventaja de la transfección es el control sobre qué receptores (5-HT2AR, 5-HT2BR o ambos) se expresan en células individuales, lo que evita la necesidad de antagonistas y simplifica el análisis. 12C16 horas después de la transfección, las células se transfirieron a un medio de formación de imágenes sin calcio (NaCl 130 mM, KCl 3,5 mM, NaH2PO4 1,25 mM, NaHCO3 24 mM, MgSO4 1,2 mM, glucosa 10 mM) y se incubaron con Fluo-4-AM (Invitrogen) a una concentración final de 5 M durante 30 min a 37C. La solución madre de Fluo-4-AM se preparó como 2 mM utilizando Pluronic al 10 %.

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